陸宏浩 衛(wèi)智權(quán) 閻 莉* 覃世椿

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530012；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001

番茄葉醇提物急性毒性及其抗氧化應(yīng)激損傷研究

陸宏浩1衛(wèi)智權(quán)2閻 莉2*覃世椿2

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530012；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001

目的：探討番茄葉醇提物的急性毒性及其對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)急性炎癥致氧化應(yīng)激損傷大鼠的保護(hù)作用。方法：急性毒性試驗(yàn)是采用經(jīng)口途徑給予番茄葉醇提物，測(cè)定小鼠的半數(shù)致死量(LD50)，并觀察急性中毒表現(xiàn)。50只SD大鼠分為正常組、模型組與番茄葉醇提物6.54g/kg、3.27g/kg和2.18g/kg給藥組，灌胃給藥10 d。腹腔注射LPS復(fù)制急性炎癥模型，以酶聯(lián)免疫吸附劑法(ELISA)測(cè)定血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHpx)和超敏C反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)水平。結(jié)果：番茄葉醇提物單次灌胃給藥的LD50為65.39g/kg。番茄葉醇提物可明顯提高急性炎癥大鼠血清SOD、GSHpx水平，并顯著降低Hs-CRP水平。結(jié)論：番茄葉醇提物可拮抗LPS引起的急性炎癥的氧化應(yīng)激損傷。

番茄葉醇提物；急性毒性試驗(yàn)；脂多糖；氧化應(yīng)激損傷

番茄葉為茄科多年生草本植物番茄LycopersiconesculentumMill的葉，具有特殊氣味。對(duì)番茄葉進(jìn)行的初步化學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)其可能含有黃酮類、酚類、生物堿、揮發(fā)性成份、皂苷、有機(jī)酸等[1-3]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，番茄莖葉粗提液對(duì)細(xì)菌具有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)霉菌的抑菌作用較弱，且葉粗提液的抑菌濃度高于莖粗提液[4]；番茄葉水提物可顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的大鼠急性炎癥及其所致氧化應(yīng)激[5-6]。番茄葉醇提取物不同極性部位的體外抗氧化試驗(yàn)表明，不同極性部位均有抗氧化作用[7]。但番茄葉醇提取物的體內(nèi)抗氧化作用未見報(bào)道，因此，研究以LPS誘導(dǎo)急性炎癥大鼠為研究對(duì)象，觀察番茄葉醇提物對(duì)其血清Hs-CRP、SOD和GSHpx的影響，初步評(píng)估番茄葉醇提物的抗急性炎癥氧化應(yīng)激損傷的作用，并觀察其對(duì)小鼠的急性毒性。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小鼠，體質(zhì)量18～22g，雌雄各半，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK桂2003-0003)。SPF級(jí)健康雄性SD大鼠50只，體重220～240g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(湘)2009-0004)。

1.2 藥品的制備 番茄葉采于廣西百色國家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)無公害蔬菜產(chǎn)業(yè)化示范園。取干燥的番茄葉粉碎，加入乙醇浸泡后回流提取，過濾，減壓回收乙醇，濃縮得到流浸膏(相當(dāng)于原生藥3.85g/mL)，備用。

1.3 試劑 大腸桿菌脂多糖(美國Sigma公司，血清型O55：B5)；超敏C反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHpx)的ELISA試劑盒均為美國R&D公司產(chǎn)品。

1.4 儀器MULTISKAN GO酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

2 方法

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，番茄葉醇提物的最大致死劑量為110g/kg，最小致死劑量為40g/kg。取小鼠60只，隨機(jī)分為6組，給藥劑量按如下方法確定：設(shè)定110g/kg為初始劑量，以1：0.85為組距得到6個(gè)給藥劑量，分別為110.0、93.5、79.5、67.6、57.4、48.8g/kg。動(dòng)物禁食不禁水12 h后灌胃給藥，給藥容積40mL/kg。給藥后連續(xù)觀察動(dòng)物的行為14d，并記錄死亡數(shù)，按改良寇氏法計(jì)算出半數(shù)致死量(LD50)。

2.2 番茄葉醇提物對(duì)血清Hs-CRP、SOD和GSHpx水平的影響 取LD50的1/10，1/20和1/30作為番茄葉醇提取物的高、中、低劑量(6.54g/kg，TLAE-H；3.27g/kg，TLAE-M；2.18g/kg，TLAE-L)。取大鼠50只隨機(jī)分為正常組、模型組和番茄葉醇提取物高、中、低劑量給藥組，每組10只。正常組和模型組給蒸餾水，各組動(dòng)物均灌胃給藥。9d后，腹腔注射LPS(4mg/kg)復(fù)制急性炎癥動(dòng)物模型。禁食不禁水12h后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，下腔靜脈穿刺取血，室溫靜置后于40℃離心(4000r/min，5min)，分離血清，分裝凍存于-20℃?zhèn)錅y(cè)血清Hs-CRP、SOD和GSHpx水平。

采用Hs-CRP、SOD和GSHpx的ELISA檢測(cè)試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。以CurveExpert曲線擬合軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，分別計(jì)算樣品濃度。

3 結(jié)果

3.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 給藥后小鼠出現(xiàn)自由活動(dòng)減少，精神萎靡，身毛豎起，反應(yīng)遲鈍，靜臥不動(dòng)等癥狀，隨著時(shí)間的推移，部分小鼠出現(xiàn)呼吸加快，興奮躁動(dòng)，步態(tài)不穩(wěn)，抽搐等中毒癥狀，并出現(xiàn)死亡。存活小鼠則連續(xù)喂養(yǎng)觀察14d，無動(dòng)物死亡。結(jié)果見表1。按改良寇氏法計(jì)算，番茄葉醇提物單次灌胃給藥的LD50為65.39g/kg，其 95%可信限為57.1～74.9g/kg。

表1 口服不同劑量番茄葉醇提物的小鼠死亡率

3.2 番茄葉醇提物對(duì)血清Hs-CRP、SOD和GSHpx水平的影響 腹腔注射LPS后，模型組大鼠血清Hs-CRP水平明顯升高，SOD和GSHpx水平則明顯降低，與正常組比較，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，TLAE的3個(gè)給藥組血清GSHpx水平及TLAE-H組、TLAE-M組的水平SOD均明顯升高，Hs-CRP水平顯著降低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TLAE-L組血清SOD水平雖然高于模型組，但其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表2。

4 討論

脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的重要組成部分，LPS進(jìn)入人體后，激活單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，促進(jìn)大量的內(nèi)源性細(xì)胞因子釋放，激發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，因此其被認(rèn)為是造成全身性炎癥綜合征的主要原因。前期研究也證明，通過給動(dòng)物腹膜注射一定劑量的LPS，可成功誘導(dǎo)急性炎癥大鼠模型[5,8]。氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基和活性氮自由基產(chǎn)生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。氧化應(yīng)激和炎癥緊密相連，抗氧化劑則可以減緩氧化應(yīng)激帶來的危害。

組別劑量/g/kgHs-CRP/μg/LSOD/U/LGSHpx/U/L正常組-2.62±0.2646.36±6.29231.23±22.77模型組0.0043.71±0.53▲▲35.44±5.29▲▲190.40±20.58▲▲TLAE-H6.542.80±0.38**42.46±4.81**222.35±23.63**TLAE-M3.272.99±0.41*40.09±3.68*216.77±25.57*TLAE-L2.183.14±0.48*38.77±4.08211.61±21.68*

注:與空白組比較,▲▲P<0.01；與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

前期的研究發(fā)現(xiàn)，番茄葉水提物可顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的大鼠急性炎癥及其所致氧化應(yīng)激[5-6]，且番茄葉乙醇提取物不同極性部位在體外均有抗氧化作用[7]。研究結(jié)果顯示，番茄葉醇提物可明顯提高急性炎癥小鼠血清SOD、GSHpx水平，并能顯著降低Hs-CRP水平。提示番茄葉醇提物可拮抗LPS引起的急性炎癥的氧化應(yīng)激損傷。急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，番茄葉醇提物單次灌胃給藥的LD50為65.39g/kg，其 95%可信限為57.1～74.9g/kg。

我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，每年都將產(chǎn)生大量的農(nóng)業(yè)廢棄物，這些廢棄物如果能得到有效利用，將成為寶貴的資源，如不經(jīng)妥善處理進(jìn)入環(huán)境，將會(huì)造成環(huán)境污染和生態(tài)惡化。中國是最主要的番茄及其副產(chǎn)品生產(chǎn)國之一，每年番茄成熟果實(shí)采摘后，番茄的莖葉都被廢棄，沒有被進(jìn)行加工利用。對(duì)番茄葉進(jìn)行抗氧化應(yīng)激性研究，對(duì)如何利用番茄葉，減少其對(duì)環(huán)境污染，改善農(nóng)村生態(tài)環(huán)境具有十分重要的意義，而且在世界能源日益枯竭的情況下，番茄葉作為一種資源，它的綜合利用及其資源化方面的研究也將對(duì)農(nóng)業(yè)與農(nóng)村可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生重大影響。

[1]潘雪峰, 楊明非, 袁鋒.番茄莖葉揮發(fā)物的氣相色譜─質(zhì)譜的定性分析[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 28(6): 119-120.

[2]孫瑩, 盧志平, 高松紅, 等.番茄莖葉揮發(fā)性成分的提取與鑒定[J].中國藥物化學(xué)雜志, 2001, 11(5): 277-278.

[3]梁臣艷, 鄧家剛, 馮旭, 等.番茄葉化學(xué)成分的初步研究[J].中國民族民間醫(yī)藥, 2014, 42(17): 26-28.

[4]?；鄯? 彭丹丹, 劉強(qiáng).番茄莖葉粗提液活性成分抑菌作用的研究[J].廣州化工, 2014, 42(17): 65-66.

[5]閻莉, 鄧家剛, 衛(wèi)智權(quán).番茄葉水提物急性毒性及其對(duì)急性炎癥的影響[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2013, 25(6):819-821.

[6]衛(wèi)智權(quán), 鄧家剛, 閻莉.番茄葉水提物對(duì)急性炎癥氧化應(yīng)激的拮抗作用[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué), 2015, 21(6):131-134.

[7]杜成智, 王卉, 馮旭, 等.番茄葉提取物不同極性部位的體外抗氧化作用[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 53(4):884-887.

[8]劉中原, 李延平.細(xì)菌脂多糖的生物活性及作用機(jī)制[J].醫(yī)學(xué)綜述, 2014, 16(2):166-169.

(編輯：梁志慶)

Acute Toxicity and Protective Effects of Tomato Leaf Alcohol Extract against Oxidative Stress InjuryInduced by Acute Inflammatory

LU Honghao1WEI Zhiquan2YAN Li2*Qin Shichun2

1.Ruikang Affiliated Hospital of Guangxi Traditional Chinese Medical University, Nanning 530012,China;2.Guangxi Traditional Chinese Medical University, Nanning 53000,China

In this research, acute toxicity of tomato leaf alcohol extract and protective effects of TLAE against oxidative stress injury induced by acute inflammatory were discussed.The oral lethal dosage (LD50) value of TLAE in mice is65.39g/kg obtained by using single dose acute toxicity testing for pharmaceuticals.Fifty SD rats were randomly divided into control group, model group and three TLAE treated groups of different dose (6.54,3.27,2.18g/kg).Acute inflammation was induced byintraperitoneal injection oflipopolysaccharide (4mg/kg).TLAEwere orallygiven once a day for 10 days.The levels of SOD, GSHpx in serum were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).TLAE enhanced the levels of SOD,GSHpxand Lower thelevel of Hs-CRP in serum.These results suggested that the orally given TLAE can markedly restrainthe oxidative stress injury with the LPS-induced acute inflammatory.

Alcohol Extract of Tomato Leaves; Acute Toxicity Test; Lipopolysaccharide; Oxidative Stress Injury

2016-11-03

廣西高等學(xué)校高水平創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)及卓越學(xué)者計(jì)劃資助項(xiàng)目(桂教人〔2014〕7號(hào))；廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室《壯醫(yī)方藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室》(桂教科研[2014]6號(hào))。

陸宏浩，男，主管藥師，研究方向?yàn)橹兴幩幚砗椭苿╅_發(fā)研究。E-mail: 1301287086@qq.com

閻莉，女，碩士，副教授，研究方向?yàn)樘烊凰幬铩⒚褡逅幬锘钚猿煞趾Y選研究。E-mail: mimaotoo@163.com

R285.5

A

1007-8517(2017)02-0052-02