施建新 閔仲生

江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029

蠶砂葉綠素水提物光動力療法對痤瘡丙酸桿菌體外抑制實(shí)驗(yàn)研究

施建新 閔仲生*

江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029

目的：評估蠶砂葉綠素水提物光動力療法在體外對痤瘡丙酸桿菌的抑制效應(yīng)。方法：以96孔板為實(shí)驗(yàn)載體，加入痤瘡丙酸桿菌，分為實(shí)驗(yàn)組、蠶砂組、細(xì)菌紅光組及細(xì)菌組，采用半導(dǎo)體固態(tài)冷光源，進(jìn)行光動力治療。結(jié)果：1000mg/mL蠶砂聯(lián)合光動力療法組各濃度的培養(yǎng)皿中未見菌落產(chǎn)生，其余各蠶砂PDT組培養(yǎng)皿中未均見菌落產(chǎn)生。蠶砂組、細(xì)菌組、細(xì)菌紅光組培養(yǎng)皿中均可見菌落產(chǎn)生。而對照組中痤瘡丙酸桿菌生長未受抑制。結(jié)論：臨床使用蠶砂葉綠素水提物聯(lián)合光動力療法治療丙酸桿菌所致痤瘡具有一定可行性，其療效可在今后臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步觀察。

蠶砂葉綠素水提物；光動力療法；痤瘡丙酸桿菌；體外實(shí)驗(yàn)

尋常痤瘡是一種臨床常見毛囊皮脂腺的慢性炎癥性疾病，各年齡皆可發(fā)病，以青少年發(fā)病率為最高[1]。因其具有一定的損容性，其治療包括外用藥物治療、系統(tǒng)治療與物理治療，隨著科技的發(fā)展其治療方式與方法也再不斷更新。光動力療法(Photodynamic Therapy，PDT)是一種近年來應(yīng)用于多種疾病治療的治療方法，光動力療法選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞和增生旺盛的細(xì)胞是其最大的特點(diǎn)，而對正常細(xì)胞無損傷，從2000年首次報(bào)道治療痤瘡有效以來[2]，目前的文獻(xiàn)多集中報(bào)道光動力治療痤瘡的有效性，少見純中藥提取物進(jìn)行光動力治療痤瘡。本文旨在通過體外實(shí)驗(yàn)，通過蠶砂葉綠素水提物光動力療法的實(shí)驗(yàn)，探索對不同濃度痤瘡丙酸桿菌的體外抑制效果，尋找一個(gè)最低的有效濃度，為以后臨床應(yīng)用尋找新的思路。

1 儀器與材料

1.1 菌株與試劑 痤瘡丙酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(Propionibacterium acnes，ATCC11827，廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心)；蠶砂葉綠素提取物(江蘇省中醫(yī)院制劑科)；瓊脂(L3027，美國Sigma-Aldrich公司)；PBS緩沖液(0.03mol/L，使用前配制)。

1.2 儀器 高能窄譜光動力治療儀，紅光波長為(640±10)nm，輸出功率2～230mW，由安徽航天生物科技有限公司提供。

2 方法

2.1 痤瘡丙酸桿菌懸液的制備 在微生物限度室復(fù)活痤瘡丙酸桿菌凍干粉，復(fù)活成功后增殖培養(yǎng)，測定痤瘡丙酸桿菌濃度，調(diào)整最大濃度為1.7×108CFU/mL(Colony Forming Units)，依次稀釋至1.7×107CFU/mL、1.7×106CFU/mL、1.7×105CFU/mL、1.7×104CFU/mL。加入96孔板中，每孔菌液200μL。

2.2 痤瘡丙酸桿菌的分組 將痤瘡丙酸桿菌分成：①實(shí)驗(yàn)組：96孔板分別加入對應(yīng)濃度蠶砂葉綠素水提物100μL，終末濃度分別為1000mg/mL、500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、62.5mg/mL、31.2mg/mL、15.6mg/mL，并充分混勻，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于37℃避光孵育15min。②3個(gè)對照組：細(xì)菌組：單純不同濃度痤瘡丙酸桿菌懸液，無照光處理；細(xì)菌紅光組：單純不同濃度痤瘡丙酸桿菌懸液，只予半導(dǎo)體固態(tài)冷光源照射；蠶砂組：不同濃度痤瘡丙酸桿菌懸液加入不同濃度蠶砂葉綠素水提物酸共同孵育，無半導(dǎo)體固態(tài)冷光源照射，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于37℃避光孵育15min。

2.3 半導(dǎo)體固態(tài)冷光源照射 將96孔板垂直置于光源下20cm，使光斑直徑為10cm，剛好將細(xì)菌孔完全覆蓋，光照能量設(shè)定為80mW/cm2，照射時(shí)長為15min。按照上述辦法將實(shí)驗(yàn)組和對照組中的b組進(jìn)行照射。

2.4 判斷抑菌效果 照光結(jié)束后，每組各孔吸取100μL菌液，混合后，每組取0.5mL混合液，澆板，37℃厭氧培養(yǎng)2d，記錄痤瘡丙酸桿菌是否增長。

3 結(jié)果

對本研究的痤瘡丙酸桿菌的生長情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見表1～3。研究中，1000mg/mL實(shí)驗(yàn)組各濃度的培養(yǎng)皿中未見菌落產(chǎn)生，其余各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)皿中未見菌落產(chǎn)生。蠶砂組、細(xì)菌組、細(xì)菌紅光組培養(yǎng)皿中均可見菌落產(chǎn)生。而對照組a、b、c中痤瘡丙酸桿菌生長未收到抑制，說明單純照光與只加蠶砂葉綠素水提物不照光，均不能抑制細(xì)菌的生長。

表1 三次處理后蠶砂組P.acnes生長情況 (CFU/mL)

注：(+)表示可見菌落生長。

表2 三次處理后細(xì)菌組和細(xì)菌紅光組P.acnes生長情況 (CFU/mL)

注：(+)表示可見菌落生長。

表3 三次處理后實(shí)驗(yàn)組P.acnes生長情況 (CFU/mL)

注：(-)表示未見菌落生長，(+)表示可見菌落生長。

4 討論

痤瘡的發(fā)生主要與雄激素與皮脂增加、毛囊皮脂腺過度角化、痤瘡丙酸桿菌及繼發(fā)炎癥反應(yīng)等原因相關(guān)。一般認(rèn)為痤瘡丙酸桿菌產(chǎn)生的各類生物酶，能分解甘油三酯，釋放具有生物活性的組胺、細(xì)胞趨化物質(zhì)、短鏈脂肪酸等參與炎癥反應(yīng)，其細(xì)胞成分中的肽聚糖可被TLR2識別，并啟動免疫應(yīng)答[3]。光動力療法是近年來迅速發(fā)展起來治療痤瘡的一項(xiàng)新型技術(shù)，是應(yīng)用特定波長光源與光敏劑，通過光動力學(xué)效應(yīng)選擇破壞病變組織的治療技術(shù)。氨基酮戊酸光動力療法現(xiàn)已被證實(shí)可以殺死細(xì)菌、真菌和酵母等微生物[4-5]。

蠶砂提取的葉綠素a的在外加激發(fā)光源以后，即可產(chǎn)生光化學(xué)反應(yīng)[6]，其主要的吸收峰存在于光譜中紅光部分的640～660nm和藍(lán)光部分的430～450nm處。早在20世紀(jì)80年代，就已經(jīng)制成性質(zhì)穩(wěn)定性，親水性良好的葉綠素衍生物，主要是通過從蠶砂中提取糊狀的葉綠素，然后進(jìn)行皂化，最后通過加入重金屬鹽的方法來取代中心鎂原子的方法制成。通過以上方法制成的葉綠素衍生物，它的治療波長介于400～700nm之間，值得注意的是在415nm和630～664nm處也具有兩個(gè)吸收最高峰值[7]，這與天然的葉綠素a治療峰值基本吻合，表明其光動力激發(fā)波段并沒有受到影響。值得注意的是，葉綠素治療痤瘡已有臨床報(bào)道，Kim JE等[8]已經(jīng)應(yīng)用提純后的葉綠素a、葉綠素b通過光動力療法治療痤瘡。

氨基酮戊酸是卟啉、血紅蛋白、葉綠素等四吡咯生物合成的中間產(chǎn)物。葉綠素a的合成過程由2分子ALA開始，通過一系列反應(yīng)，生成原卟啉Ⅸ, 原卟啉Ⅸ之前的在是葉綠素與血紅蛋白生物合成中都是一樣的，下一步反應(yīng)中PpⅨ與亞鐵結(jié)合就成亞鐵血紅素，而PpⅨ與鎂結(jié)合就成鎂原卟啉。鎂原卟啉再接受甲基、環(huán)化后成為具有第Ⅴ環(huán)的原脫植醇基葉綠素，最終形成葉綠素a。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，考慮到ALA-PDT體外抑制P.acnes生長的結(jié)果[9]，蠶砂葉綠素水提物同樣具有良好抑制作用。實(shí)驗(yàn)組中1000mg/mL 的細(xì)菌生長被抑制，然而1000mg/mL蠶砂組細(xì)菌的生長依舊生長，說明此次實(shí)驗(yàn)中，痤瘡丙酸桿菌在細(xì)胞外濃度的改變的情況下，并沒有出現(xiàn)痤瘡丙酸桿菌破裂、死亡的現(xiàn)象。另外幾組濃度下的實(shí)驗(yàn)組未能抑制P.acnes生長，說明此次蠶砂葉綠素水提物濃度已成為能達(dá)到有效的抑菌濃度。因?yàn)楸敬螌?shí)驗(yàn)并沒有設(shè)置孵育時(shí)間，考慮葉綠素本身的疏水性，所以假設(shè)痤瘡丙酸桿菌外是發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)的主要場所。細(xì)胞外直接發(fā)生的光化學(xué)反應(yīng)可能直接損傷痤瘡丙酸桿菌的細(xì)胞壁，當(dāng)損傷達(dá)到一定程度時(shí)，痤瘡丙酸桿菌的生長被完全抑制，所以葉綠素提取物濃度越高，P.acnes損傷程度也就越高，抑制效果應(yīng)當(dāng)越明顯，推測一定濃度范圍內(nèi)葉綠素濃度與抑制效果應(yīng)當(dāng)是一個(gè)線性的關(guān)系，且結(jié)果也符合以上推測。表1～2結(jié)果表明，光動力效果的要素缺一不可，缺少了光照、光敏劑都不能產(chǎn)生光動力效應(yīng)，不能產(chǎn)生應(yīng)抑菌的效果，本實(shí)驗(yàn)完全符合光動力實(shí)驗(yàn)的特性。

通過試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，蠶砂葉綠素水提物光動力療法可以抑制P.acnes體外的生長，為進(jìn)一步探索蠶砂葉綠素水提物臨床治療痤瘡的可能性，發(fā)揮我國中醫(yī)藥在治療痤瘡方面的優(yōu)勢提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(編輯：梁志慶)

Inhibitory Effect of Silkworm Chlorophyll Extract Photodynamic Therapy on Propionibacterium Acnes

SHI Jianxin MIN Zhongsheng*

Jiangsu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210029，China

Objective To evaluate the effect of silkworm chlorophyll extract photodynamic therapy on Propionibacterium acnes.Methods 96-well cell culture plates were used for experimental carriers and Propionibacterium acnes suspension was added to these wells,which were divided into experimental group and three control groups.With Semiconductor as the exctiation source.Results 1000mg/mL Silkworm-PDT group can completely inhibited the growth of each concentration of P.acnes， the rest Silkworm-PDT group can’t completely inhibited the growth of each concentration of P.acnes.Silkworm groups, the group of bacteria and bacterial phototherapy groups can’t completely inhibited the growth of each concentration of P.acnes.The growth of P.acnes was not inhibited in three control groups.Conclusion The experimental results provide the experimental basis for the clinical use of silkworm chlorophyll extract in the treatment of acne.

Silkworm Sand Chlorophyll Aqueous Extract；Photodynamic Therapy；Propionibacterium Acnes；In Vitro Studies

2016-11-12

施建新(1987-)，男，漢族，住院醫(yī)師，碩士，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)基礎(chǔ)與臨床。E-mail：mervynshi@foxmail.com

閔仲生(1957-)，男，漢族，主任醫(yī)師，教授，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)基礎(chǔ)與臨床。E-mail：minzhsh@sina.com

R246.7

A

1007-8517(2017)02-0041-03