王 麗 陳 芬 符德歡* 高 麗 戚育芳 張曉南

1.云南省藥物研究所、云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心、云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650111； 2.云南中醫(yī)學(xué)院,云南 昆明 650500

小兒腹痛草中獐牙菜苦苷與龍膽苦苷的含量測(cè)定

王 麗1陳 芬2符德歡1*高 麗1戚育芳1張曉南1

1.云南省藥物研究所、云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心、云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650111； 2.云南中醫(yī)學(xué)院,云南 昆明 650500

目的：建立小兒腹痛草中獐牙菜苦苷與龍膽苦苷的含量測(cè)定方法。方法：色譜柱：Phenomenex luna C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-水溶液(22：78)；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)239nm；柱溫：30℃。結(jié)果：獐牙菜苦苷的線性范圍0.0488～4.875μg(r=0.9998)，平均回收率為99.57%，RSD=3.30%；龍膽苦苷的線性范圍0.0215～2.150 μg(r=0.9995)，平均回收率為97.80%，RSD=2.04%。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可以作為小兒腹痛草中獐牙菜苦苷與龍膽苦苷的含量測(cè)定方法。

小兒腹痛草；獐牙菜苦苷；龍膽苦苷；HPLC；含量測(cè)定

小兒腹痛草為龍膽科獐牙菜屬斜莖獐牙菜SwertiapatensBurk.的全草?！缎氯A本草綱要》以伸展獐牙菜之名載其：“全草，味苦，有解痙、止痛、安眠功能。用于小兒功能性腹痛”[1]，云南彝族用其全草治療消化不良、腹痛、牙痛等，且歷史已久[2]。小兒腹痛草生于海拔1100～2500m的石灰?guī)r松林下、石灰?guī)r腐殖質(zhì)土壤中及石灰?guī)r山坡草地，分布于云南中部、東北部及四川南部[3]。小兒腹痛草含獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、齊墩果酸等成分，獐牙菜苦苷主要具有解痙、鎮(zhèn)痛作用；龍膽苦苷具有利膽、抗炎、健胃、降壓等作用，具有較好的開(kāi)發(fā)前景。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)該藥材，將以其所含獐牙菜苦苷及龍膽苦苷為目標(biāo)成分進(jìn)行定量分析研究。據(jù)查閱文獻(xiàn)，目前還未見(jiàn)用高效液相色譜法測(cè)定小兒腹痛草中獐牙菜苦苷及龍膽苦苷含量的文獻(xiàn)報(bào)道，本文建立了相應(yīng)的測(cè)定方法，為進(jìn)一步深入開(kāi)發(fā)該藥材提供了一定的理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-2010AHT日本島津高效液相色譜儀，LCsolution工作站；FA2004N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 獐牙菜苦苷(批號(hào)：0785-200203，純度98.6%)、龍膽苦苷對(duì)照品(批號(hào)：110770-200510，純度99%)等購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。甲醇(色譜純，MERCK，批號(hào)：122250)；水為超純水。小兒腹痛草經(jīng)云南省藥物研究所高麗、戚育芳正高級(jí)工程師鑒定為斜莖獐牙菜SwertiaPatensBurk.，藥用部位為全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex luna C18(4.6mm×250mm，5m)；流動(dòng)相：甲醇-水溶液(22：78)；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)239nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；理論塔板數(shù)按獐牙菜苦苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000、按龍膽苦苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取獐牙菜苦苷7.8 mg、龍膽苦苷2.15mg分別置于10mL容量瓶中，加甲醇制成0.78mg/L，0.215mg/L的溶液，搖勻，0.45m的微孔濾膜過(guò)濾后作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3 樣品溶液的制備 取小兒腹痛草藥材細(xì)粉0.2g，精密稱定，加甲醇10mL/每次，超聲2次，每次30min，過(guò)濾，合并濾液后定容至25mL，搖勻，即得供試品溶液，0.45 m微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液用于測(cè)定樣品中龍膽苦苷的含量。

精密移取供試品溶液1mL于10mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45m的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液用于測(cè)定樣品中獐牙菜苦苷的含量。

2.4 線性關(guān)系考察 依次精密吸取獐牙菜苦苷、龍膽苦苷對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL，分別置于10mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣10μL，記錄色譜圖以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程獐牙菜苦苷Y=774600X-21622(r=0.9998)，龍膽苦苷Y=1E+0.6X-7700.9(r=0.9995)，獐牙菜苦苷與龍膽苦苷分別在0.04875～4.875 μg(r=0.9998)、0.0215～2.15 μg(r=0.9995)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 分別取濃度為0.195 mg/mL的獐牙菜苦苷，0.086 mg/mL的龍膽苦苷對(duì)照品溶液，按選定色譜條件重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果獐牙菜苦苷、龍膽苦苷峰面積的RSD分別為0.09%、0.69%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取同一批小兒腹痛草樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算獐牙菜苦苷和龍膽苦苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.63%、2.08%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h測(cè)定峰面積，計(jì)算獐牙菜苦苷和龍膽苦苷峰面積的RSD分別為0.78%、3.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

2.8.1 獐牙菜苦苷的加樣回收率試驗(yàn) 稱取已測(cè)定含量的小兒腹痛草藥材0.2g，3份，每次加甲醇10mL，超聲2次，每次30min，過(guò)濾，合并濾液后定容至25mL，搖勻，即得3個(gè)平行供試品溶液。分別移取每份供試品溶液1mL于25mL容量瓶中，每個(gè)供試品溶液3份，共9份，加入獐牙菜苦苷低、中、高3份對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算平均回收率為99.57%，RSD為3.30%。見(jiàn)表1。

表1 獐牙菜苦苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8.2 龍膽苦苷的加樣回收率試驗(yàn) 稱取已測(cè)定含量的小兒腹痛草藥材0.2g，共9份，加入龍膽苦苷低、中、高3份對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算平均回收率為97.80%，RSD為2.04%。見(jiàn)表2。

表2 龍膽苦苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定 精密稱取兩個(gè)產(chǎn)地小兒腹痛草藥材粉末0.2g，每個(gè)產(chǎn)地三份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1～4，表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果 (n=2)

3 討論

3.1 提取方法選擇 分別選擇了冷浸法(甲醇冷浸過(guò)夜)，超聲法(甲醇超聲30min)，熱浸法(甲醇回流30min)三種提取方法提取樣品，結(jié)果超聲提取時(shí)兩種苦苷的含量高于冷浸法和熱浸法，故選擇超聲提取。

3.2 提取溶劑選擇 分別選擇以甲醇、95%乙醇、75%乙醇為溶劑超聲提取樣品，結(jié)果甲醇提取時(shí)提取率較乙醇提取時(shí)高，故選擇甲醇為提取溶劑，這與獐牙菜屬常用提取溶劑相吻合。

3.3 提取時(shí)間考察 分別考察了甲醇超聲提取15、30、45min時(shí)對(duì)樣品中兩種苦苷含量的影響，結(jié)果與提取15min相比，提取30min時(shí)兩種苦苷的含量明顯增加，但與提取45min時(shí)相差不大，故選擇30min的提取時(shí)間。

3.4 提取次數(shù)考察 在甲醇超聲提取30min的前提下，考察其提取次數(shù)對(duì)兩種苦苷含量的影響，結(jié)果2次與3次相差不大，結(jié)果確定為2次。

通過(guò)對(duì)小兒腹痛草中獐牙菜苦苷和龍膽苦苷含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)小兒腹痛草中獐牙菜苦苷的含量較高，高達(dá)24.175%。根據(jù)已報(bào)道文獻(xiàn)，該屬植物中獐牙菜苦苷含量在0.091%～13.137%之間不等。

獐牙菜苦苷能明顯抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有顯著的鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜作用，而獐牙菜的鎮(zhèn)痛和解痙作用是獐牙菜苦苷治療胃腸道疼痛的藥理基礎(chǔ)[4]。測(cè)定獐牙菜苦苷的含量，在一定程度上揭示小兒腹痛草是一味很好的止痛藥。目前，以小兒腹痛草為主成分的中藥制劑甚少，本文的研究可為以后更好的開(kāi)發(fā)利用該藥材提供部分理論依據(jù)。

[1]吳征鎰.新華本草綱要(第二冊(cè))[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1991.

[2] 梁鉅忠，雷偉亞.云南民族藥斜莖獐牙菜的實(shí)驗(yàn)研究[J].云南醫(yī)藥，1984，5(2)：107-108 .

[3] 羅開(kāi)均.彝族藥“落孺疴”原植物的研究[J].中藥通報(bào)，1984，9(5)：11-12.

[4] 郭愛(ài)華.龍膽科獐牙菜屬藥用植物化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，6(1)：57-59 .

(編輯：陶希睿)

Determination of the Content of National Medicine inSwertiapatensof Swertiamarin and Gentiopicroside

WANG Li1CHEN Fen2FU Dehuan1*GAO Li1QI Yufang1ZHANG Xiaonan1

1.Yunnan Institute of Materia Medica/ Yunnan Bai Yao Group Innovation and R&D Center Yunnan Province Company/Key Laboratory for TCM and Ethnic Drug of New Drug Creation,Kunming 650111,China;2.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China

Objective To estebulish a HPLC method for the determination ofSwertiapatens.Methods The analysis was carried out on all analytical column C18(4.6mm×250mm, 5μm) .Mobile phase was methyl alcohol-water(22：78).The flow rate was 1.0 ml·min-1and the detective wavelength was set at 239nm with column temperature of 30℃．Rusults The linear range was 0.0488～4.875μg(r=0.9998)and the average recovery was 99.57% with theRSDof 3.30% for swertiamrin.The linear range was 0.0215～2.150μg(r=0.9995)and the average recovery was 97.80%with theRSDof 2.04% for Gentiopicroside.Conclution This method was accurate and reliable.It can be used for determination of swertiamrin and Gentiopicroside in the Swertia patens.

SwertiaPatens；Swertiamrin；Gentiopicroside；HPLC；Determination of Content

2016-10-31

王麗(1983-)，女，工程師，主要從事中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，E-mail：liwangshengyao@163.com

符德歡(1976-)，男，高級(jí)工程師，主要從事天然藥物、民族藥資源調(diào)研與藥材鑒定。 E-mail：fudehuan@126.com

R283

A

1007-8517(2017)02-0035-03