張愛麗 高亞芳 黎太米 譚文紅 錢子剛

云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500

藥物研究

DNA條形碼在主要滇產(chǎn)石斛鑒別中的應(yīng)用

張愛麗 高亞芳 黎太米 譚文紅*錢子剛*

云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500

目的：選擇云南境內(nèi)應(yīng)用面較廣、市場流通量較大的14個(gè)石斛品種，建立其 DNA條形碼鑒定方法。方法：結(jié)合Genbank數(shù)據(jù)庫序列，選擇ITS、psbA-trnH、matK、rbcL等4條常用序列對(duì)石斛DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增和測序，利用MEGA5.0計(jì)算種間種內(nèi) K2P遺傳距離并構(gòu)建NJ樹，同時(shí)采用Taxon DNA軟件計(jì)算Barcoding gap(條形碼種內(nèi)種間遺傳差異)。結(jié)果：ITS序列的K2P種內(nèi)遺傳距離小于種間遺傳距離，NJ樹可以很好地將不同品種的石斛分開，且有較明顯的Barcoding gap。結(jié)論：ITS序列可以作為鑒別這14種滇產(chǎn)主要石斛的優(yōu)選序列。

滇產(chǎn)石斛；DNA條形碼；分子鑒別

石斛為我國著名中藥材，具有生津益胃、滋陰清熱、潤肺止咳等功效[1]。是歷代本草和歷版《中國藥典》收載的品種?！吨袊幍洹?2015年版)收載的石斛藥材為蘭科植物金釵石斛(Dendrobiumnobile)、鼓槌石斛(Dendrobiumchrysotoxum)、流蘇石斛(Dendrobiumfimbriatum)的栽培品及同屬植物的近似種[2]。

石斛作為云南特有藥材之一，產(chǎn)量占全國的60%。在云南境內(nèi)，除藥典品種鐵皮石斛以外，市場流通的石斛品種多達(dá)20幾種[3]。但這些品種沒有專屬的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使得這類石斛藥材質(zhì)量得不到控制。因此，控制其質(zhì)量、保證臨床用藥的安全和療效，必先對(duì)石斛藥材的來源進(jìn)行嚴(yán)格的鑒定。但是，石斛屬 (DendrobiumSW.)作為蘭科 (Orchidaceae) 最大的屬之一，其種類繁多，且許多種類形態(tài)非常相似，從外觀形態(tài)上對(duì)石斛屬植物進(jìn)行鑒別有一定的困難[4]。

DNA條形碼鑒定是現(xiàn)階段一個(gè)精準(zhǔn)、穩(wěn)定并且易于操作的鑒定方法。本實(shí)驗(yàn)收集了云南省境內(nèi)應(yīng)用面較廣、市場流通量較大的14個(gè)石斛品種，選擇ITS、psbA-trnH、matK、rbcL等4條常用條形碼片段對(duì)其進(jìn)行了序列的分析比較，以期為鑒別這些主要滇產(chǎn)石斛品種提供分子依據(jù)，使得其基源鑒定更為準(zhǔn)確可靠，為今后石斛的質(zhì)量控制研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器和材料

1.1 樣品來源 實(shí)驗(yàn)通過走訪調(diào)查，文獻(xiàn)查閱，收集了云南省境內(nèi)應(yīng)用面廣、市場流通大的14個(gè)石斛品種，每個(gè)品種保證至少3個(gè)或以上重復(fù)樣品，實(shí)驗(yàn)中不能獲得的序列信息，均從Genbank下載。具體信息見表1。

表1 品采集信息及Genbank下載序列信息

注：“ +” 為實(shí)驗(yàn)中獲得的序列，Genbank下載序列為實(shí)驗(yàn)中未獲得的序列。

1.2 儀器SW-CJ-1D潔凈工作臺(tái)(江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠)；高速冷凍離心機(jī)(HITACHI)；電泳儀(Bio-Rad)；微型電泳槽(Bio-Rad)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)；PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀(Bio-Rad)；移液器(范圍100～1000μL，20～200μL，0.5～10μL(Eppordorf)。

1.3 試劑 4SRedPlus核酸染色劑(上海生工，生產(chǎn)批號(hào)：A606695)；瓊脂糖(Biowest，生產(chǎn)批號(hào)：111860)；MixTag酶(Takara公司，生產(chǎn)批號(hào)：A3201A)。

2 方法

2.1DNA提取 采集的新鮮石斛葉片用變色硅膠干燥, 采用植物基因組DNA快速提取試劑盒 (Bioteke, 北京)，提取石斛樣品的總DNA。

2.2PCR擴(kuò)增PCR體系總體積為 25μL, 其中包含: 2×TaqPCRMix12.5μL、DNA模板 2μL、ddH2O8.5μL、引物各 1μL。PCR反應(yīng)條件及引物序列見表2。擴(kuò)增結(jié)束后，用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像分析系統(tǒng)分析。

2.3 純化測序PCR產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行純化后，測序。測序工作由上海生物的ABI-PRISM3730DNA自動(dòng)測序儀完成。每個(gè)產(chǎn)物樣品采用雙向測序。

表2 引物序列及PCR程序

2.4 數(shù)據(jù)處理 測序峰圖采用Contigexpress序列拼接軟件校對(duì)拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)，利用MEGA5.0對(duì)拼接后序列進(jìn)行手工排序矯正后，比對(duì)分析；同時(shí)從GenBank數(shù)據(jù)庫中搜集并下載未獲得的ITS、psbA-trnH、rbcL、matK序基因序列；共計(jì)221條(實(shí)驗(yàn)獲得和GenBank下載)；運(yùn)用MEGA5.0 軟件，以密花石豆蘭 (Bulbophyllum odoratissimum) 為外類群[5]，并基于K2P距離模型構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹[6]，計(jì)算種間種內(nèi)的K2P遺傳距離；采用TaxonDNA軟件做出各候選序列的barcodinggap圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 序列信息、PCR擴(kuò)增效率和測序成功率PCR擴(kuò)增效率和測序成功率是評(píng)價(jià)DNA條形碼的一個(gè)重要指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)4個(gè)候選序列的PCR擴(kuò)增效率(出現(xiàn)明顯PCR條帶即判定成功)和測序成功率(測序重復(fù)2次后獲得高質(zhì)量序列即為成功)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。其中rbcL序列由于長度較長，其擴(kuò)增和測序成功率都非常底，不到70%和60%。psbA-trnH序列的擴(kuò)增成功率為100%，但其測序成功率較低，僅為67%。matK序列的擴(kuò)增成功率為100%，其測序成功率為89%。ITS序列無論擴(kuò)增還是測序其成功率都最高，都接近100%。另外，各序列GC含量差異較大，ITS序列最高，平均含量達(dá)到 53.7%，matK序列GC含量較低，平均僅為32.6%。詳細(xì)信息見表3。

表3 擴(kuò)增序列基本信息

3.2 不同DNA條形碼序列種類種間差距 種內(nèi)種間差異也是評(píng)價(jià)條形碼序列的重要指標(biāo)。合適的條形碼序列其種間變異要大于種內(nèi)變異，以便準(zhǔn)確鑒別同屬不同種的物種[7]。研究基于K2P模型，計(jì)算了14個(gè)石斛品種的種間種內(nèi)遺傳距離 (表4)。結(jié)果顯示，4條序列中，ITS序列的種間遺傳距離為0.01～0.20，種內(nèi)遺傳距離為0.00～0.08，除疊鞘石斛(D.aurantiacum)以外，其余品種的種間遺傳距離都大于種內(nèi)遺傳距離。而psbA-trnH、matK及rbcL序列的種間遺傳距離基本與種內(nèi)遺傳距離相一致。見表4。

表4 基于K2P計(jì)算石斛種間種內(nèi)遺傳距離

3.3 不同序列barcodinggap檢驗(yàn)Barcodinggap是指序列種內(nèi)與種間遺傳變異由于顯著差異而形成的間隔區(qū)[8-9]，如圖1為4條序列的barcodinggap圖。matK、psbA-trnH及rbcL序列均無明顯的間隔區(qū)。相對(duì)其他序列，ITS序列有較為明顯的間隔區(qū)，種內(nèi)與種間變異明顯分為兩大部分，且其分布較高的遺傳變異也可明顯區(qū)分，因此在barcodinggap分析方面，ITS序列為鑒別不同石斛較理想條形碼序列。

3.4NJ系統(tǒng)樹的構(gòu)建與分析NJ樹是基于K2P遺傳距離建立，通過分析不同物種間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近以鑒別物種的系統(tǒng)發(fā)育樹，該方法可直觀展示不同物種的系統(tǒng)關(guān)系。如圖(2-5)所示，以密花石豆蘭 (Bulbophyllum odoratissimum) 為外類群[5]，基于K2P距離模型構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹[6]，結(jié)果顯示ITS序列可以將不同物種分到不同的分支上，將不同品種的石斛區(qū)分開來，而matK、psbA-trnH及rbcL序列均不能將不同品種的石斛完全具為1個(gè)分支。

4 討論

DNA條形碼是指利用有足夠變異、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段，在種內(nèi)特異性與種間多樣性中建立的一種新的生物身份識(shí)別系統(tǒng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地識(shí)別和鑒定[10]。理想的條形碼序列應(yīng)具有足夠的種間差異(種間差異應(yīng)小于種內(nèi)差異)，易于擴(kuò)增，且引物通用性好，能夠通過雙向測序得到高質(zhì)量的序列[11]。本實(shí)驗(yàn)選取了當(dāng)前在植物學(xué)界推薦的4個(gè)熱點(diǎn)候選序列(ITS、matK、rbcL、psbA-trnH序列)對(duì)主要的14個(gè)滇產(chǎn)石斛品種進(jìn)行鑒別[12]，四個(gè)片段的鑒別能力各有差別。

4.1matK序列對(duì)不同品種石斛的鑒定能力評(píng)價(jià)matK及片段有較高的的擴(kuò)增和測序成功率，分別為100%和89%。計(jì)算K2P遺傳距離表明，其種內(nèi)和種間差異保守。barcodinggap分析顯示，并沒有明顯的barcodinggap。NJ樹也不能將不同品種的石斛很好的聚為一支(圖3)。同時(shí)，其作為條形碼的最主要爭議是引物通用性差[13-14]，在不同物種間的通用性較小。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)中不建議選用該片段作為鑒定片段。

4.2psbA-trnH序列對(duì)不同品種石斛的鑒定能力評(píng)價(jià)psbA-trnH片段的PCR擴(kuò)增和測序成功率，分別為100%和67%。根據(jù)barcodinggap分析顯示，其分布較高的遺傳變異與分布較低的遺傳變異可以明顯區(qū)分。但K2P遺傳距離表明，其種間遺傳距離沒有明顯大于種內(nèi)遺傳距離，不能將不同種間的差異表現(xiàn)出來。同時(shí)，NJ樹也不能將不同品種的石斛很好的聚為一支。鑒于此，本實(shí)施不推薦psbA-trnH序列作為區(qū)分這14個(gè)石斛品種的理想條形碼片段。

4.3rbcL序列對(duì)不同品種石斛的鑒定能力評(píng)價(jià) 與其它三個(gè)片段相比較，rbcL的序列長度最長，在本實(shí)驗(yàn)中，其最長片段長度接近1400bp。因此，其擴(kuò)增和測序的成功率都不高，僅為70%和59%。計(jì)算其K2P遺傳距離表明，其種間種內(nèi)遺傳距離無明顯區(qū)別(0.00～0.01)。基于K2P遺傳距離構(gòu)建的NJ樹也不能將不同品種的石斛很好的聚為一支。文獻(xiàn)研究報(bào)道[15]，rbcL的變異主要存在于種以上的水平，其鑒別主要應(yīng)用在科屬及以上水平。鑒于此，rbcL也并不是鑒別該14個(gè)品種石斛的最佳條形碼。

4.4ITS序列對(duì)不同品種石斛的鑒定能力評(píng)價(jià) 對(duì)于ITS片段，由于具有序列長度較短，易于擴(kuò)增，對(duì)樣本要求較低。在本實(shí)驗(yàn)中，其擴(kuò)增和測序成功率均接近100%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，除了疊鞘石斛(D.aurantiacum)的K2P種內(nèi)遺傳距離為0.06，大于種間遺傳距離，其余各品種的種間遺傳距離均大于種內(nèi)遺傳距離。使用Mega5.0軟件進(jìn)行1000次自展計(jì)算，對(duì)14個(gè)石斛品種進(jìn)行NJ樹的構(gòu)建，由圖2可以看出，以密花石豆蘭 (Bulbophyllum odoratissimum)為外類群[6]，基于ITS序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)聚類樹，不同的石斛品種基本上都聚在一起。同時(shí)barcodinggap分析顯示，其種內(nèi)與種間變異區(qū)分為兩大部分，有明顯的barcodinggap，其分布較高的遺傳變異也可以明顯區(qū)分。綜合以上分析，ITS序列可以作為鑒別不同石斛物種的優(yōu)選序列。

綜上，本實(shí)驗(yàn)篩選了4個(gè)熱點(diǎn)DNA條形碼片段，用以區(qū)分云南市場上流通量較大的14個(gè)石斛品種。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ITS序列是鑒別這14個(gè)石斛品種較為理想的DNA條形碼片段。ITS序列作為國際上承認(rèn)的通用核心條形碼，在植物類的鑒別中有著廣泛的應(yīng)用前景。彭祿[16]等通過ITS序列鑒定了獨(dú)活的17個(gè)種，得到四帶芹類可作為獨(dú)活的替補(bǔ)品的結(jié)論。劉靜[17]等研究也發(fā)現(xiàn)，ITS序列可將17種藥用石斛完全鑒別開來。ITS條形碼在中藥鑒定領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用將實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥原植物及其藥材和飲片的準(zhǔn)確快速鑒。

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(編輯：梁志慶)

Application of DNA Barcoding in species identification ofDendrobiumwidely used in Yunnan

ZHANG Aili GAO Yafang LI Taimi TAN Wenhong*QING Zigang*

Yunnan University of Chinese Traditional Medicine,Kunming 650500,China

Objective To identify 14 species of Dendrobium which widely used in Yunnan province by DNA barcoding.Methods Three chloroplast sequences including psbA-trnH, matK, rbcL and an ribosomal DNA ITS sequence of the 14 species were comparatively analyzed.K2P distances were calculated and NJ Tree was performed applying MEGA 5.0.Meanwhile, Barcoding gap were calculated by Taxon DNA.Results The interspecific K2P distance of ITS were higher than the intraspecific one.And NJ tree could also divide species into different clades.The barcoding-gap were obvious between intra-and inter-species.Conclusions ITS sequence can be the optimal barcode to identify the 14 species ofDendrobium.

Genus ofDendrobiumin Yunnan; DNA Barcoding; Molecular Identification

2016-11-04

中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)基地建設(shè)(2014RE021) 。

張愛麗(1986-)，女，漢族，博士，講師，研究方向?yàn)橹兴庂Y源分子生物學(xué)。

譚文紅，女，副主任藥師，從事中藥民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作。 錢子剛，男，教授，從事中藥資源學(xué)分子生物學(xué)方向研究。

R197

A

1007-8517(2017)02-0011-06