梁丹，沈威，劉璐，楊子健，先文娟，殷嬌,熊靜

(遼寧省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院，遼寧 沈陽 110000)

2種木霉菌對楊樹葉枯病致病菌的抑菌活性研究

梁丹，沈威，劉璐，楊子健，先文娟，殷嬌,熊靜

(遼寧省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院，遼寧 沈陽 110000)

楊樹葉枯病〔Alternariaalternata(Fr.) Keissl〕分布廣泛，是楊樹主要病害之一。目前針對楊樹葉枯病主要是化學(xué)防治為主，大量使用殺菌劑污染環(huán)境，同時促使該地區(qū)抗性種群的形成。木霉菌是一種資源豐富的拮抗微生物，已作為生物制劑應(yīng)用于一些樹種的病害防治。文章以生防菌綠色木霉菌(Trichodermaviride)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)為試材，研究2種木霉菌株對楊樹葉枯病病原菌株生長的拮抗作用，及其對楊樹葉枯病菌株生長的抑制作用，以期為利用木霉菌有效防治楊樹葉枯病提供理論依據(jù)。

楊樹葉枯??；哈茨木霉；綠色木霉

楊樹葉枯病是由半知菌亞門的鏈格孢菌〔Alternariaalternata(Fr.) Keissl〕引起的一種楊樹葉部病害，它既能危害插條苗，又會感染實(shí)生苗，發(fā)病最重者整株葉片全部枯死。[1]該病從楊樹葉片抽生開始，危害楊樹葉片、嫩梢和幼莖，5—6月染病最重，受害的葉片會出現(xiàn)近圓形、多角形或不規(guī)則形的病斑，直徑可達(dá)1～5 mm，病斑多時可連成大斑，病斑上有黑色霉?fàn)钗?，嫩梢和嫩莖上的病斑凹陷，呈菱形，上有綠色霉層。[2]該病原菌寄生性不強(qiáng)，但寄主范圍很廣，常發(fā)生在農(nóng)作物、經(jīng)濟(jì)作物、果樹、蔬菜及雜草上，近年來又在用材林樹種及綠化樹種上發(fā)現(xiàn)，受害地區(qū)廣泛，主要集中在我國東北、西北、華北地區(qū)。而用材林上細(xì)鏈格孢菌，最早發(fā)現(xiàn)于一些楊樹雜交品種的葉部，形成大量的壞死型病斑，造成葉枯，提早落葉。楊樹葉枯病可危害毛白楊、小葉楊、小青楊、銀白楊、北京楊等多種楊樹，對楊樹苗木及幼林造成嚴(yán)重危害：如近幾年發(fā)生在北京市東北旺苗圃的毛白楊連年受此病的危害，1981年葉片感病率達(dá)100%，葉片大量提前脫落，四川省天全縣楊樹苗圃2000年感病率達(dá)85%以上，同時在黑龍江省也曾大面積發(fā)生，導(dǎo)致很多苗圃的苗木死亡，給林業(yè)生產(chǎn)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為影響當(dāng)?shù)貤顦鋬?yōu)質(zhì)高產(chǎn)的主要因素之一，找到治療之法已刻不容緩。

目前，由于化學(xué)殺菌劑對環(huán)境、人體帶來的副作用以及病原菌日益明顯的抗藥性，新的治療方法的出臺勢在必行，利用木霉菌作為生物殺菌劑的研究引起了世界各國的廣泛興趣。木霉菌(Trichodermaviride)是自然界中普遍存在并有豐富資源的拮抗微生物，常見于植物殘體及動物糞便上，從植物的根圍及種子、球莖表面即可分離到，具有廣泛適應(yīng)性、產(chǎn)生拮抗物的多樣性、寄生的廣譜性和對環(huán)境影響小等特點(diǎn)，成為最有希望的生防因子。該菌是重要的植物真菌病原菌的抑制菌，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，通過營養(yǎng)爭奪、重寄生、產(chǎn)生抗性物質(zhì)或溶解酶類可以抑制許多病原菌，因此深入研究、開發(fā)和生產(chǎn)優(yōu)良木霉菌，對于防治植物真菌病害，促進(jìn)生產(chǎn)具有重要意義。在木霉菌的種群中有一大類被稱為拮抗(T.viride)。鉤狀木霉(T.hamatum)、長枝木霉(T.longibrachiatum)、康氏木霉(T.koningii)以及新近歸為粘帚霉屬的綠粘帚霉(Gliocladiumvirenstrichodermavirens) 都屬于拮抗類， 但目前農(nóng)業(yè)生防上商業(yè)化的產(chǎn)品主要是哈茨木霉菌株及少量的綠色木霉菌株，它們在植病生防中正日益受到重視，應(yīng)用技術(shù)也不斷突破。多年來，人們對木霉菌的生防應(yīng)用、生物藥劑的開發(fā)以及生防機(jī)制做了很多嘗試和深入研究。國內(nèi)外許多學(xué)者將其用于防治水稻紋枯病，現(xiàn)在，木霉還可以用于葉面、花器和果實(shí)的保護(hù)：在葡萄園內(nèi)用綠色木霉的孢子液于始花期至收獲期噴施，可以降低灰霉引起的藤蔓腐爛以及果實(shí)在儲藏期的腐爛，有效地防治灰霉病。在楊樹爛皮病的生防研究中發(fā)現(xiàn)：木霉對爛皮病菌也有較好的防治效果，林間防治楊樹爛皮病治愈率達(dá)92.4%，預(yù)防效果達(dá)82.4%。[3]茆振川報道了木霉菌對蘋果輪紋病的抑制作用，[4]而且國外已有商品化的木霉制劑問世，如美國的Topshield(哈茨木霉T-22菌株)和以色列的Trichodex(哈茨木霉T39菌株)；同時在國內(nèi)，也已經(jīng)有關(guān)于其防治白涓病、猝倒病、灰霉病等的報道。木霉的拮抗機(jī)制也是多樣性的，一般有競爭作用、抗生作用、重寄生作用等。據(jù)不完全資料統(tǒng)計，木霉至少對18個屬29種病原真菌在體外或體內(nèi)表現(xiàn)有拮抗作用。目前葉枯病的防治，在很大程度上還是依賴于化學(xué)防治，一般從發(fā)病開始在整個生長季節(jié)噴灑2～3次的40%的乙膦鋁300倍液，或75%百菌清500倍液，或50%的多菌靈1 000倍液防治，并通過及時清理枯枝落葉帶出林外集中燒毀或埋漚制肥的方法減少病源，從而減少發(fā)病率。利用化學(xué)方法防治楊樹葉枯病時，化學(xué)藥物在抑制病原菌的同時也將殺死樹體上有益的拮抗微生物，同時也會使病原菌產(chǎn)生抗藥性并污染環(huán)境。在可持續(xù)發(fā)展呼聲越來越高的今天，化學(xué)公害越來越嚴(yán)重，木霉作為一類資源豐富的拮抗微生物，在植物病害生物防治中扮演著越來越重要的角色；同時，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，木霉的生防效果和穩(wěn)定性有了顯著的提高，并展示出廣闊的應(yīng)用前景；這些為木霉菌對楊樹葉枯病的抑制作用提出了可能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌種

病原菌：病株取樣楊葉枯病病菌

生防菌：綠色木霉、哈茨木霉

1.1.2 培養(yǎng)基的制備

試驗所用培養(yǎng)基均采用PDA培養(yǎng)基。

配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，硫酸鎂1.5 g，磷酸二氫鈉3 g，瓊脂20 g，水1 000mL；

將洗凈后帶皮的馬鈴薯切碎，加入定量的水煮沸30 min，用紗布濾出馬鈴薯殘渣，加入瓊脂，加熱使瓊脂完全融化，再加入糖，并補(bǔ)入適量的水，使最后的總量仍然為原量。分裝在試管和三角瓶中，然后滅菌備用。

1.2 病原菌的鑒別

1.2.1 癥狀觀察 選取具有典型楊樹葉枯病癥狀的楊樹葉片觀察，其癥狀如下：初期，感病葉片上產(chǎn)生隱約可見的褐色斑，以后病斑逐漸擴(kuò)大。病斑黃色，中央褐色。后期，病斑上產(chǎn)生黑褐色霉?fàn)钗?，為病原菌的分生孢子梗和分生孢子。病斑可相互連成大斑，全葉枯死。

1.2.2 病原菌觀察及鑒定 選取具有典型癥狀的楊樹葉片病部，進(jìn)行鏡檢。直接用針挑取少許菌絲體，放在加有水滴的載玻片上，加蓋玻片后在顯微鏡下鏡檢。

1.3 病原菌的分離和純化

1.3.1 楊樹葉枯病病原菌的分離 選擇新發(fā)病的植株器官或組織作為分理材料然后進(jìn)行組織表面消毒，消毒時先用70%酒精浸泡病組織2～3 s，趕走病組織表面氣泡，然后用次氯酸鈉消毒，消毒后用滅菌水沖洗2～3次。

次氯酸鈉消毒液配方30%(現(xiàn)配現(xiàn)用)：次氯酸鈉(NaClO3)，30 g；水，100 mL。

取楊樹葉枯病的病葉，直接用移植鉤挑取菌株的菌絲，接種于PDA平板中央，于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3d。3d之后，觀察各菌落形態(tài)，直接用針挑取少許的菌組織放在加有水滴的載玻片上，加蓋玻片后在顯微鏡下檢視，根據(jù)菌落形態(tài)，確定病原菌。

1.3.2 楊樹葉枯病病原菌的純化 采用微塊單孢分離法，挑取供純化菌種的孢子少許加于試管內(nèi)的無菌水中，搖動混合1～2 min使孢子充分散開。調(diào)節(jié)孢子濃度到10倍視野中2～5個孢子。取此孢子懸浮液2～3 mL倒入4%水洋菜平板表面，輕輕左右搖動培養(yǎng)皿使孢子液均勻展布于培養(yǎng)基表面靜置5 min，使大部分孢子沉淀，然后傾斜培養(yǎng)皿，用吸管吸去多余的孢子液。用滅菌刀將帶有分散孢子的水洋菜平板切成0.3 cm×0.3 cm小塊，移至載玻片上檢查。逐個檢查，見有單個孢子的微塊，隨即用移植鏟移入PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每皿可放4～5塊[16]。

1.4 試驗方法

在直徑9cm培養(yǎng)皿的PDA平板培養(yǎng)基上，相距3 cm分別接入直徑0.6 cm培養(yǎng)5d的近乎同質(zhì)、等量的楊樹葉枯病病原真菌和木霉菌(Trichodermaspp．)。對照則在平板中心各接人直徑0.6 cm 的楊葉枯病病原菌和木霉菌(Trichodermaspp．)。每個處理設(shè)置5個重復(fù)，置于生化培養(yǎng)箱中，用散射光、25 ℃培養(yǎng)。每12 h測量菌落的半徑，連續(xù)觀察3 d。

拮抗結(jié)果計算時，采用兩菌落相向半徑進(jìn)行拮抗生長測定。

由于拮抗真菌抑制病原真菌的同時，其本身也被病原真菌所抑制，因此在計算拮抗效果時，采用相對抑菌效果，即拮抗真菌被抑制1%個單位所產(chǎn)生的效果。被抑制率與相對抑菌效果的計算[17]如下：

被抑制率=〔(單獨(dú)培養(yǎng)菌落半徑)-(菌落趨向半徑)〕/(單獨(dú)培養(yǎng)菌落半徑)×100%；

相對抑菌效果=病原菌被抑制率/拮抗菌被抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種真菌單獨(dú)培養(yǎng)

表1 3種真菌單獨(dú)培養(yǎng)時菌落半徑的增長情況

注：Al—Alternariaalternate(Fr.) Keissl；Tv—Trichodermaviride；Th—Trichodermaharzianum

由表1數(shù)據(jù)作曲線圖得到圖1。

由表1和圖1我們可以看出，3種真菌單獨(dú)培養(yǎng)時，無論何時測量2種木霉菌的生長半徑都明顯大于病原菌的生長半徑，未達(dá)到72h時，2種木霉菌都已長滿皿，說明2種木霉菌的生長速度大于病原菌，在營養(yǎng)爭奪上木霉菌生長速度快可能會占有優(yōu)勢；2種木霉菌相比較，Th的生長速度快于Tv。

圖1 3種真菌單獨(dú)培養(yǎng)菌落生長情況

2.2 綠色木霉(T. viride)與病原菌拮抗培養(yǎng)

T.viride菌株與病原菌的對峙培養(yǎng)結(jié)果見表2。

表2 T. viride菌株與病原菌的對峙培養(yǎng)結(jié)果

由表2中數(shù)據(jù)可以看出木霉菌(T.viride)的相對半徑在不斷增大，楊樹葉枯病病原菌的相對半徑先增大，在48 h時增加到最大值0.69 cm，后在綠色木霉菌的作用下菌落半徑逐漸減小。

T.viride與病原菌菌株的拮抗效果見表3。

表3 T. viride菌株與病原菌對峙培養(yǎng)的拮抗效果

由表3可以看出，木霉菌(T.viride)在拮抗培養(yǎng)過程中的被抑制率從12 h到24 h先是增加到最大值12.03%，然后從24 h到48 h時在減小到最小值2.91%，從48 h到60 h時又增大；病原菌的被抑制率在相對培養(yǎng)過程中一直在增加，當(dāng)72 h時達(dá)到最大為64.52%；相對抑制效果在12 h到24 h時先減少到最小值1.66，從24 h到48 h不斷增大，48 h時達(dá)到最大值13.38，從48 h到60 h又減小。

2.3 哈茨木霉(T.harzianum)與病原菌拮抗培養(yǎng)

T.harzianum菌株與病原菌的對峙培養(yǎng)結(jié)果見表4。

表4 T.harzianum菌株與病原菌的對峙培養(yǎng)結(jié)果

由表4可以看出木霉菌T.harzianum的相對生長半徑不斷增大；病原菌的相對半徑從12 h到60 h一直在增大，但在60 h到72 h時相對半徑減小。

病原菌分別與T.harzianum菌株的拮抗效果見表5。

表5 T.harzianum菌株與病原菌對峙培養(yǎng)的拮抗效果

由表5可以看出木霉菌(T.harzianum)在拮抗培養(yǎng)過程中被抑制率不斷增大，最大被抑制率為46.35%；病原菌在拮抗培養(yǎng)過程中被抑制率也不斷增長，最大抑制率為61.29%；相對抑制效果12 h最大為4.33，隨后不斷減小，最小值為0.62，到60 h時又增大為0.98。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

通過上述對楊樹葉枯病病原菌鏈格孢菌的鑒別、分離、純化培養(yǎng)以及其與綠色木霉、哈茨木霉對峙培養(yǎng)試驗初步得出以下結(jié)論：

供試的兩種木霉菌Tv和Th菌株對楊樹葉枯病有一定的空間和營養(yǎng)競爭作用，對其病原菌的生長都有一定的抑制作用。兩種木霉菌在生長速度上與病原菌相比有一定的優(yōu)勢，因此可較快的爭奪營養(yǎng)與空間；至72h，病原菌被Trichoderma的抑制率由高至低分別達(dá)到：Trichodermaviride為64.52%：Trichodermaharzianum為61.29%。而相對抑制效果由高至低為：Trichodermaviride、Trichodermaharzianum；其相對抑制效果最高分別達(dá)到13.38和4.33，因此可得出抑制效果最佳菌株為Trichodermaviride。

3.2 討論

楊樹葉枯病是一種由鏈格孢菌引起的葉部病害，防治其發(fā)生的關(guān)鍵是防治鏈格孢菌生長。因此，通過綠色木霉菌、哈茨木霉菌分別與楊樹葉枯病鏈格孢菌進(jìn)行拮抗試驗，分別計算出抑制率與相對抑制效果，從而找出對楊樹葉枯病具有較好抑制作用的木霉菌株，本文認(rèn)為相對抑制效果較高的為綠色木霉菌，但是由于本試驗只是從抑制率和相對抑制效果的角度進(jìn)行說明，有一定的局限性，因此還需要從生理和分子生物學(xué)的方面進(jìn)行深入研究。

木霉菌作為普遍存在并具有豐富資源的拮抗微生物，在植物生防中具有不可替代的地位。木霉菌對病原菌的拮抗作用具有廣譜性的特點(diǎn)，但不同種，同種的不同菌株都存在著拮抗作用的差異。國內(nèi)對木霉菌生物防治方面的研究還局限于木霉菌對植物病原菌拮抗機(jī)理的初步分析，拮抗菌株的篩選，發(fā)酵條件的優(yōu)化等，主要劑型為粉劑和可濕性粉劑。國內(nèi)登記生產(chǎn)木霉菌制劑的企業(yè)雖然較少，但木霉菌制劑在市場上的銷售增長較為迅速，目前為止，木霉菌生防制劑已占據(jù)了真菌殺菌劑近一半的市場份額。國外木霉菌相關(guān)的研究與應(yīng)用起步比較早，發(fā)展非常迅速，已有多種登記注冊的產(chǎn)品，例如木霉菌 T22 和 T39。國外對木霉菌生防作用機(jī)制的研究也較為深入，不僅在木霉菌發(fā)酵過程控制方面具有先進(jìn)的經(jīng)驗和設(shè)備，并且對木霉菌所產(chǎn)生的具有生物防治活性的代謝產(chǎn)物的種類、化學(xué)結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理等方面也進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究。特別是近幾年，國外利用一些新的方法如蛋白質(zhì)組學(xué)分析和基因報告系統(tǒng)等，研究植物、病原菌及木霉菌三方互作的關(guān)系。通過基因表達(dá)的差異分析進(jìn)一步了解木霉菌生防作用的機(jī)理，從而為開發(fā)木霉菌新的生物防治技術(shù)提供理論支持。然而相關(guān)的研究在國內(nèi)還未引起足夠的重視。

近些年，木霉菌的研究與應(yīng)用得到了快速的發(fā)展。結(jié)合遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)及生態(tài)學(xué)等研究方法，木霉菌及其代謝產(chǎn)物在促進(jìn)植物生長，增加營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率，提高農(nóng)作物的產(chǎn)量，以及增強(qiáng)對病害的防御性方面勢必有更為廣闊的應(yīng)用前景。特別是在倡導(dǎo)綠色農(nóng)業(yè)的大背景下，木霉菌的大面積推廣應(yīng)用已成為構(gòu)建現(xiàn)代和高效的生物防治病蟲害體系中不可或缺的一部分。

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Antimicrobial Activity of Two Kinds of Trichoderma to Pathogen of Leaf Blight from Poplar Trees

Liang Dan, Shen Wei, Liu Lu, Yang Zijian, Xian Wenjuan, Yin Jiao,Xiong Jing

(Liaoning Provincial Forestry Investigation and Planning Institute,Shenyang,110000,China)

Leaf blight from the poplar trees is widely distributed, which is one of the main diseases of poplar. Currently, it is mainly chemical control of poplar leaf blight, polluting the environment with fungicide, Formation of Resistant Populations. Trichoderma is a resource-rich antagonistic microorganisms and has been used as a biological agent in disease prevention and control of some tree species. In this paper,TrichodermavirideandTrichodermaharzianumwere used to study the antagonistic effect of twoTrichodermastrains on the growth of leaf blight of poplar and the effects ofTrichodermaviride, Growth inhibition, with a view to the use ofTrichodermaeffective control of poplar blight provide a theoretical basis.

Poplar leaf blight;Trichodermaharzianum;Trichodermaviride

1005-5215(2017)01-0028-04

2016-12-06

梁丹(1990-)，女，遼寧沈陽人，大學(xué)，助理工程師，現(xiàn)從事林業(yè)調(diào)查規(guī)劃工作.

S435.121.48

A

10.13601/j.issn.1005-5215.2017.01.008