張 蔚, 張志想, 李世訪

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

我國部分地區(qū)鮮食辣椒及其加工品中辣椒輕斑駁病毒的調(diào)查

張 蔚, 張志想, 李世訪*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

本研究利用RT-PCR技術(shù)對(duì)我國部分地區(qū)鮮食辣椒和辣椒加工品中的辣椒輕斑駁病毒Peppermildmottlevirus(PMMoV)進(jìn)行了調(diào)查。其中,鮮食辣椒樣品(249份)中PMMoV檢出率為75.5%;147份辣椒加工品中有97份檢測(cè)到PMMoV,且所采集的每一類別的辣椒制品中都有陽性樣品。調(diào)查結(jié)果表明:PMMoV不僅廣泛分布于我國辣椒種植區(qū),而且在多種辣椒加工品中的檢出率也較高。該研究進(jìn)一步明確了PMMoV的來源及可能的傳播途徑,為該病毒的防控提供了理論依據(jù)。

辣椒輕斑駁病毒; RT-PCR; 鮮食辣椒; 辣椒加工品

辣椒輕斑駁病毒Peppermildmottlevirus(PMMoV)屬于煙草花葉病毒屬Tobamovirus,能夠侵染茄科植物,可引起辣椒果實(shí)褪綠斑駁、畸形,造成產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。該病毒最早在美國發(fā)現(xiàn),現(xiàn)在已在世界范圍內(nèi)廣泛存在[1]。PMMoV可以種傳和汁液摩擦傳毒,在干燥的植物病殘?bào)w上病毒可以存活25年,介體不易傳毒,帶毒種子、感病植株和病土是重要的侵染源[2]。值得注意的是,PMMoV可能會(huì)危及人類的健康,因?yàn)樗谌梭w內(nèi)的存在可能與發(fā)燒、腹痛及瘙癢等臨床病癥有關(guān)[3]。因此,有必要查清PMMoV的來源及進(jìn)入人體的途徑。目前,已經(jīng)從辣椒醬中檢測(cè)到了PMMoV[3-4],這暗示PMMoV可能存在于各種辣椒加工品中。為此,本試驗(yàn)對(duì)我國部分辣椒主產(chǎn)區(qū)的鮮食辣椒及辣椒絲、辣椒粉、醬菜等加工品進(jìn)行了PMMoV的檢測(cè),進(jìn)一步明確了PMMoV的來源及可能的新的傳播途徑,為該病毒的有效防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

鮮食辣椒采自山東、湖南、四川、山西、河南以及貴州的辣椒種植區(qū)及集貿(mào)市場,部分樣品表現(xiàn)變色、斑駁、畸形、或出現(xiàn)褐色壞死條紋。辣椒加工品購自大型超市,包括醬菜類、剁辣椒、精制辣椒、辣椒醬、辣椒粉、辣椒絲、泡菜。

TRIzol試劑購自天根生物技術(shù)(北京)有限公司;dNTPs、RNAse抑制劑、2×TaqMix購自寶生物工程(大連)有限公司;M-MLV RTase購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司。

引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成;測(cè)序由金唯智生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取

鮮食辣椒總RNA提取采用TRIzol法,詳見產(chǎn)品使用說明書;辣椒加工品總RNA提取參考Callahan等[5]和Morgens等[6]有關(guān)果實(shí)中RNA的提取方法。

1.2.2 RT-PCR、克隆與測(cè)序

利用PMMoV的特異性引物PMMoV-CP1/CP2[7]對(duì)提取的總RNA進(jìn)行RT-PCR。反轉(zhuǎn)錄體系如下:RNA 1 μL、下游引物(10 μmol/L)1 μL,95℃變性7 min,立即置于冰上冷卻5 min;隨后加入M-MLV RTase 0.5 μL、5×M-MLV buffer 2.5 μL、dNTPs 0.5 μL、RNase抑制劑(40 U/μL)0.5 μL,補(bǔ)充ddH2O至12.5 μL,37℃孵育60 min。PCR反應(yīng)體系為25 μL:反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL,上游引物(10 μmol/L)和下游引物(10 μmol/L)各1 μL,2×TaqMix 12.5 μL,ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件:94℃變性5 min;94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸35 s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),切膠回收條帶,并進(jìn)行克隆測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮食辣椒中PMMoV的檢測(cè)

本研究利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)鮮食辣椒中的PMMoV,其中陽性樣品可擴(kuò)增出一條大小約576 bp的片段(圖1)。鮮食辣椒樣品中PMMoV的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明:249份辣椒樣品中有188份呈PMMoV陽性,檢出率為75.5%。不同地區(qū)的PMMoV的檢出率均高于69.1%,但無明顯差異(表1)。這說明PMMoV廣泛分布于我國辣椒種植區(qū)且侵染率較高。

2.2 辣椒加工品中PMMoV的檢測(cè)

除鮮食辣椒外,本研究還利用RT-PCR技術(shù)對(duì)辣椒加工品進(jìn)行了檢測(cè),PMMoV陽性樣品可以擴(kuò)增到576 bp大小的目的條帶(圖2),檢測(cè)結(jié)果表明,辣椒加工品中PMMoV的檢出率也較高。147份樣品中有97份檢測(cè)到PMMoV,檢出率為66.0%。所采集的每一類別的辣椒制品中均有陽性樣品。其中,辣椒粉和辣椒絲中PMMoV的陽性率甚至高于80%。即使經(jīng)過傳統(tǒng)的發(fā)酵、腌制等加工過程后,含有辣椒的泡菜和醬菜中PMMoV的檢出率仍大于41.7%(表2)。

3 討論

我國于1994年首次在新疆辣椒上發(fā)現(xiàn)PMMoV[8],后來山東青島、河北保定、北京、廣東、海南等地區(qū)先后有該病毒發(fā)生的報(bào)道,其發(fā)生分布范圍在不斷地發(fā)展蔓延[7-11]。本研究從湖南、貴州、山西、四川、河南及山東6個(gè)省份的鮮食辣椒中檢測(cè)到PMMoV,進(jìn)一步明確了該病毒在我國的發(fā)生分布情況。除此之外,我們從7份辣椒醬中檢測(cè)到PMMoV,這一結(jié)果與Peng等[3]和Colson等[4]的發(fā)現(xiàn)相一致;另外,還從初級(jí)加工品辣椒絲、辣椒粉、手工精制辣椒以及辣椒深加工制品醬菜和泡菜中檢測(cè)到PMMoV,且具有較高的檢出率。這表明PMMoV通過食用辣椒制品進(jìn)入人體的幾率很高?？紤]到PMMoV可能與一些臨床病癥的發(fā)生有關(guān)[3],需對(duì)此足夠重視,以保障食品安全及人類健康。

圖2 辣椒加工品中部分陽性樣品RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 RT-PCR result of PMMoV in some positive pepper processed products

采集地點(diǎn)Place樣品數(shù)量/個(gè)Numberofsamples陽性樣品數(shù)/個(gè)Numberofpositivesamples陽性率/%Positiveratio貴州六盤水Liupanshui,Guizhou302583.3湖南衡陽Hengyang,Hunan483981.3山西呂梁Lüliang,Shanxi241979.2四川樂山Leshan,Sichuan483777.1河南商丘Shangqiu,Henan302170.0山東青州Qingzhou,Shandong684769.1總計(jì)Total24918875.5

一般認(rèn)為,PMMoV的主要侵染源為帶毒種子、感病植株和病土,但隨著科學(xué)研究的不斷深入,一些新的侵染源和傳播途徑被人們所認(rèn)識(shí)。近些年有研究發(fā)現(xiàn)在人體排泄物中也能夠檢測(cè)到PMMoV,且具有侵染活性[12],由此可以推測(cè)出PMMoV通過人體進(jìn)行傳播的新途徑。農(nóng)家肥、灌溉水等可能是PMMoV的新侵染源,在農(nóng)事操作的過程中,再次侵染寄主植物。

表2 辣椒加工品中PMMoV的檢測(cè)結(jié)果

Table 2 Detection of PMMoV in pepper processed products

樣品類別Sampletypes樣品數(shù)量/個(gè)Numberofsamples陽性樣品數(shù)/個(gè)Numberofpositivesamples陽性率/%Positiveratio辣椒粉Chilipowder302686.7辣椒絲Slicedchili352982.9剁辣椒Choppedhotpepper231356.5醬菜Pickle15853.3手工精制辣椒Handmadepepper17952.9辣椒醬Peppersauce15746.7泡菜Pickledcabbage12541.7總計(jì)Total1479766.0

[1] Antignus Y, Lachman O, Pearlsman M, et al. A new pathotype ofPeppermildmottlevirus(PMMoV) overcomes theL4resistance genotype of pepper cultivars [J]. Plant Disease,2008, 92(7): 1033-1037.

[2] Ikegashira Y, Ohki T, Ichiki U T, et al. An immunological system forthe detection ofPeppermildmottlevirusin soil from green pepper fields [J]. Plant Disease, 2004, 88 (6):650-656.

[3] Colson P, Herve R, Christelle D, et al.Peppermildmottlevirus, a plant virus associated with specific immune responses, fever, abdominal pains, and pruritus in humans[J]. PLoS ONE, 2010, 5(4): e10041.

[4] Peng Jiejun, Shi Bingbin, Zheng Hongying, et al. Detection ofPeppermildmottevirusin pepper sauce in China [J]. Archives of Virology, 2015, 160(8): 2079-2082.

[5] Callahan A M, Morgens P H, Walton E.Isolation andinvitrotranslation of RNAs from developing peach fruit [J]. HortScience, 1989, 24: 356-358.

[6] Morgens P H, Callahan A M, Dunn L J, et al. Isolation and sequencing of cDNA clones encoding ethylene-induced putative peroxidases from cucumber cotyledons [J]. Plant Molecular Biology, 1990, 14(5): 715-725.

[7] 夏惠娟, 李志勇, 郭京澤. 保定地區(qū)一種新辣椒病毒病的鑒定[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 29(6): 65-67.

[8] 向本春,謝浩,崔星明,等. 新疆辣椒輕微斑駁病毒的分離鑒定[J]. 病毒學(xué)報(bào), 1994,10(3):240-245.

[9] 姚玉榮,陳國華,馮蘭香,等.北運(yùn)蔬菜基地辣椒病毒病病原種類的分子檢測(cè)[J]. 中國蔬菜, 2013(10): 84-89.

[10]Wang X F, Liu F, Zhou G, et al. Detection and molecular characterization ofPeppermildmottlevirusin China[J]. Journal of Phytopathology, 2006, 154(11/12): 755-757.

[11]黃粵, 馬榮群, 翟曉靈. 辣椒溫和斑點(diǎn)病毒PMMV外殼蛋白基因的克隆和序列測(cè)定[C]∥蔬菜分子育種研討會(huì)論文集, 2004.

[12]Zhang Tao, Mya B, Lee W H, et al. RNA viral community in human feces: prevalence of plant pathogenic viruses [J]. PLoS Biology, 2006, 4(1): 108-118.

(責(zé)任編輯：楊明麗)

The survey ofPeppermildmottlevirusin pepper and processed products in China

Zhang Wei, Zhang Zhixiang, Li Shifang

(StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

The survey ofPeppermildmottlevirus(PMMoV) in pepper and processed products in China was conducted using RT-PCR.The results showed that the occurrence of PMMoV was 75.5% in 249 pepper fruits, and there were 97 positive samples in 147 pepper processed products. Moreover, positive samples were able to be found in each kind of collected pepper processed product. These results suggested that PMMoV was widely distributed in pepper production areas in China, and its detection rate was relatively high in many pepper processed products. Therefore, this study further clarifies the origin and possible routes of transmission of PMMoV, and provides a theoretical basis for the effective control of this virus.

Peppermildmottlevirus(PMMoV); RT-PCR; pepper fruit; pepper processed products

2016-03-04

2016-03-15

國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目(GJFP2015014);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng) (201303028)

S436.418.12

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.027

* 通信作者 E-mail: sfli@ippcaas.cn