呼格吉樂，石蕓萍，薛東力，蘭海霞

促紅細胞生成素對神經(jīng)膠質細胞增殖、凋亡、遷移能力的影響

呼格吉樂1，石蕓萍2，薛東力2，蘭海霞3

目的 探討促紅細胞生成素(EPO)對神經(jīng)膠質細胞增殖、凋亡、遷移能力的影響，為EPO神經(jīng)保護作用機制的研究提供依據(jù)。方法 體外培養(yǎng)用不同濃度EPO混合培養(yǎng)基培養(yǎng)U251細胞，用噻唑藍(MTT)法篩選EPO的最佳濃度，以EPO最佳濃度的細胞為實驗組，未加EPO細胞為陰性對照組，通過細胞克隆實驗檢測細胞增殖水平變化、通過劃痕實驗檢測細胞遷移能力變化、通過transwell實驗檢測細胞侵襲能力變化、通過細胞流式術觀察EPO對神經(jīng)膠質細胞凋亡能力的變化。結果 通過MTT實驗檢測EPO最佳濃度為300 IU/L；克隆實驗檢測發(fā)現(xiàn)細胞增殖水平增加；劃痕實驗檢測發(fā)現(xiàn)細胞遷移能力增加；Transwell實驗檢測發(fā)現(xiàn)細胞侵襲能力增加；細胞流式術發(fā)現(xiàn)細胞的凋亡能力降低。結論 本實驗得出EPO可促進U251細胞的增殖、遷移、侵襲，并抑制其凋亡，因此證實EPO對神經(jīng)細胞具有保護作用，在臨床上為新生兒腦損傷的早期干預治療提供一條新途徑和理論根據(jù)。

促紅細胞生成素；神經(jīng)保護；增殖；凋亡；遷移

促紅細胞生成素(EPO)是一種含唾液酸的特異性糖蛋白激素，胎兒肝臟和成人腎臟是合成、分泌EPO的主要器官，EPO主要通過與紅細胞膜上特異性促紅細胞生成素受體(erythropoietin receptor，EPOR)結合促進血液循環(huán)中紅細胞增殖、分化、成熟及釋放，恢復紅系祖細胞造血能力，可促進紅細胞生成、骨髓紅系祖細胞生長及血管生成，抑制紅系祖細胞凋亡，參與胎盤血管發(fā)生等過程[1]。近幾十年來，國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn)EPO除促進造血外還具有神經(jīng)保護和修復作用，并可改善遠期神經(jīng)預后[2]。有研究證實[3-4]：EPO對各種腦損傷有治療作用，特別是新生兒腦損傷，EPO的早期應用能減輕腦損傷甚至避免腦損傷。近年來，EPO認為是防治新生兒腦損傷最有前途的藥物之一[5]。然而EPO治療和防治新生兒腦損傷的作用機制目前還不明確，有待進一步研究。本研究觀察EPO對神經(jīng)膠質U251細胞增殖、侵襲、遷移、凋亡的影響，為研究EPO神經(jīng)保護作用機制奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞 神經(jīng)膠質U251細胞株，購自中科院上海細胞庫。

1.1.2 實驗藥品 EPO。

1.1.3 主要實驗試劑及儀器 MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶、雙抗、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(MTT)試劑、試劑、Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒、transwell小室、電熱恒溫培養(yǎng)箱、離心機、生物安全柜、水浴鍋、倒置顯微鏡、酶聯(lián)免疫檢測儀、流式細胞儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將U251細胞置于MEM完全培養(yǎng)基中，在5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，3 d～4 d更換1次培養(yǎng)液；使用0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化、傳代，并取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 實驗分組 采用MTT實驗篩選EPO最佳濃度，以EPO最佳濃度的細胞為實驗組，未加EPO細胞為陰性對照組。

1.2.3 MTT實驗 收集對數(shù)生長期細胞，消化并計數(shù)，按2×103個/孔接種到96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后棄原培養(yǎng)液，分別加入0 IU/mL、150 IU/mL、300 IU/mL、450 IU/mL EPO繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24 h、48 h、72 h加入MTT(濃度為5 g/L)溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清液，加150 μL DMSO，在搖床上低速振蕩10 min后利用酶標儀在490 nm處測定吸光度值。篩選EPO最佳濃度。

1.2.4 細胞克隆實驗 取對數(shù)生長期細胞用胰酶消化并垂打成單個細胞，按100個/孔接種于細胞培養(yǎng)皿中，實驗組加含EPO培養(yǎng)液，對照組加不含EPO的培養(yǎng)液，在5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，3 d后顯微鏡下計數(shù)。

1.2.5 劃痕實驗 將對數(shù)生長期細胞按1.0×106/mL密度接種于6孔板，待細胞覆蓋板底80%以上時，用20 μL加樣槍頭在每孔中劃一直線，使用無菌PBS(pH 7.4)漂洗3次去除懸浮細胞，實驗組加入含EPO培養(yǎng)液，對照組加不含EPO的培養(yǎng)液，分別取0 h、24 h觀察細胞在同一劃痕處遷移情況并照相。

1.2.6 侵襲實驗(transwell) 取實驗組及對照組的細胞用胰酶消化并計數(shù)，以每孔5 000個細胞接種于transwell小室中，室上加100 μL MEM基礎培養(yǎng)基，室下加600 μL含20%FBS的MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)8 h～12 h；棄原培養(yǎng)液，用沾PBS棉簽擦去膜上未侵襲細胞，4%多聚甲醛固定10 min；常規(guī)HE染色10 min；蒸餾水沖洗浮色后晾干，顯微鏡下觀察計數(shù)。

1.2.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡 將對數(shù)生長期細胞消化制成細胞懸液，按1.0×106/mL密度接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后胰酶消化制成細胞懸液，調整細胞密度為5×105/mL，每組各取2 mL細胞懸液離心后加4 ℃預冷的PBS(pH7.4)漂洗3次，離心1 000 r/min，5 min，將細胞重懸于100 μL結合緩沖液，依次加入5 μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(PI)和5 μL碘化丙啶(FITC)，輕輕震蕩混勻，室溫下避光放置15 min后加入400 μL結合緩沖液，立即上機檢測，以CellQuest分析軟件計算細胞凋亡率。

2 結 果

2.1 MTT實驗 從24 h開始，在同一時間各濃度間比較，150IU/mL組與0IU/mL組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；300 IU/mL組與0 IU/mL組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；450 IU/mL組與0 IU/mL組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。上述實驗結果說明，MTT實驗篩選出EPO最佳濃度為300 IU/mL。詳見表1、圖1。

組別24h48h72h0IU/mL組 0.221±0.0470.346±0.0610.491±0.062150IU/mL組0.223±0.0310.372±0.0370.506±0.015300IU/mL組0.324±0.0151)0.463±0.0501)0.638±0.0661)450IU/mL組0.254±0.0340.376±0.0500.501±0.084 與0IU/mL組比較,1)P<0.05。

圖1 各組U251細胞OD值比較

2.2 細胞克隆形成數(shù)比較 克隆實驗通過計數(shù)細胞克隆形成數(shù)來測定單個細胞的增殖能力。細胞克隆實驗結果顯示，300 IU/mL組顯著高于0 IU/mL組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。由此可得出：EPO可促進U251細胞增殖。詳見表2。

表2 細胞克隆形成數(shù)比較(±s) 個

2.3 細胞劃痕實驗比較 通過細胞劃痕修復實驗觀察EPO300 IU/mL組與0 IU/mL組細胞遷移能力的影響，實驗結果如圖所示：24 h U251細胞的遷移距離，300 IU/mL組明顯大于0 IU/mL組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此得出結論，EPO可以增加U251細胞的遷移能力。詳見圖2和表3。

300 IU/mL 0 IU/mL

圖2 U251細胞劃痕實驗圖片

cm

2.4 transwell比較 transwell侵襲實驗結果顯示，300 IU/mL組穿過transwell小室的細胞數(shù)明顯多于0 IU/mL組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。transwell侵襲實驗結果說明，EPO可增加U251細胞的侵襲能力。詳見圖3、表4。

300 IU/mL 0 IU/mL

圖3 U251細胞侵襲力的變化(×200)

(±s) 個

2.5 細胞凋亡率比較 通過使用Annexin VFITC/PI雙標法檢測細胞凋亡情況，流式細胞分析儀結果顯示，EPO作用于U251細胞24 h后均出現(xiàn)凋亡，300 IU/mL組細胞凋亡率明顯低于0 IU/mL組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖4、表5。

0 IU/mL

300 IU/mL

圖4 U251細胞流式圖

表5 細胞凋亡率比較(±s) %

3 討 論

新生兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)生物學和解剖生理結構發(fā)育不成熟，其代償能力較差，且易受缺血、缺氧和感染因素影響而造成損傷。隨著新生兒醫(yī)學及新生兒重癥監(jiān)護技術不斷提高，早產(chǎn)兒成活率增加，隨之早產(chǎn)兒腦損傷及其后遺癥也日益突出，腦損傷發(fā)生率與出生體重及出生胎齡具相關性，體重越低、胎齡越小越容易發(fā)生腦損傷[6]。腦室周圍-腦室內(nèi)出血(PIVH)及腦室周圍白質軟化(PLV)是早產(chǎn)兒腦損傷的主要類型[7]，也是導致新生兒神經(jīng)行為發(fā)育障礙及死亡的主要原因。早產(chǎn)兒生命健康和生存質量受腦損傷后遺癥的嚴重影響，目前國內(nèi)外對早產(chǎn)兒腦損傷的預防與治療措施尚未取得滿意效果，處于探索階段。

EPO作為一種新型的神經(jīng)保護劑得到國內(nèi)外許多研究者認可。近年來EPO成為國內(nèi)外防治新生兒腦損傷的研究熱點，但關于EPO防治早產(chǎn)兒腦損傷研究國內(nèi)外均較少，隨著早產(chǎn)兒腦損傷模型建立，越來越多動物模型發(fā)現(xiàn)EPO對早產(chǎn)兒腦損傷具有神經(jīng)保護作用，但其機制尚未明確。Wei等[8]通過早產(chǎn)大鼠PVL造模實驗探討EPO的神經(jīng)保護作用，實驗結果得出EPO可降低小膠質細胞的活化并可減少少突膠質細胞(OL)損傷，促進髓鞘形成，但正常OL成熟及髓鞘化不受影響。除此之外，還發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)大鼠腦損傷后其運動功能經(jīng)EPO治療后明顯好于未治療組。動物實驗發(fā)現(xiàn)EPO對PWMD的少突膠質細胞具有保護作用，且可促進損傷后髓鞘形成[9]。劉后存等[10]通過臨床觀察EPO治療早產(chǎn)兒腦損傷得出，EPO可改善早產(chǎn)兒腦損傷預后，加速神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復。早期應用EPO不僅可改善早產(chǎn)兒腦損傷的預后，而且還可減少其后遺癥發(fā)生。迄今為止，動物實驗在EPO預防早產(chǎn)兒腦損傷的研究中占主要地位。文獻報道EPO可引起血壓升高并可導致抗EPO抗體形成和紅細胞發(fā)育不良，減少細胞表面EPOR表達，EPO使用量越大其不良反應也隨之越多[11-15]。故EPO用于早產(chǎn)兒PWMD治療仍需臨床試驗證實。

本實驗結果表明，外源性EPO可促進神經(jīng)膠質U251細胞增殖、侵襲、遷移，抑制其凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。證實EPO對神經(jīng)細胞具有保護作用，在臨床上為新生兒腦損傷的早期干預治療提供一條新的途徑和理論根據(jù)。此外，患有腫瘤且貧血病人：不建議使用EPO來進行貧血的治療。該實驗不足之處在于只通過體外細胞實驗探討EPO的神經(jīng)保護作用，對EPO的體內(nèi)實驗還需進一步探討。

[1] 熊濤，屈藝，母得志.促紅細胞生成素與新生兒腦損傷[J].中華兒科雜志，2011，49(10)；756-760.

[2] Alexander ML，Hill CA，Rosenkrantz TS，et al.Evaluation of the therapeutic benefit of delayed administration of erythropoietin following early hypoxic-ischemic injury in rodents[J].Dev Neurosic，2012，6(34)：515-524.

[3] Mc Pherson RJ，Juul SE.Recent trends in erythropoietin-mediated neuroprotection[J].Int J Dev Neurosci，2008，26(1)；103-111.

[4] 何金水，黃仲玲，楊鴻，等.早期應用rhu-EPO對早產(chǎn)兒神經(jīng)行為發(fā)育的影響[J].中國當代兒科雜志，2008，5(10)：586-588.

[5] Kumral A，Tuzun F，Oner MG，et al.Erythropoietin in neonatal brain protection： the past，the present and the future[J].Brain Dev，2011，33(8)：632-643.

[6] 王楊.促紅細胞生成素治療早產(chǎn)兒腦損傷療效分析[J].安徽衛(wèi)生職業(yè)技術學院學報，2012，5(11)：20-21.

[7] 金越，陸繼紅，鮑魚魚，等，尿S-100B蛋白動態(tài)變化對早產(chǎn)兒腦損傷的診斷價值[J].臨床兒科雜志，2015，33(1)：44-47.

[8] Wei L，Yan S，Plane JM，et al.Neuroprotective potential of erythropoietin and its derivative carbamylated erythropoietin in periventricular leukomalacia[J].Experimental Neurology，2011，230(230)：227-239.

[9] 胡燕，蔣犁，張敏，等.促紅細胞生成素對腦室周圍白質軟化新生大鼠髓鞘磷脂蛋白和神經(jīng)生長相關蛋白的影響[J].中華實用兒科臨床雜志，2010，25(14)：1046-1048.

[10] 劉后存，閏平.促紅細胞生成素對改善早產(chǎn)兒腦損傷的效果研究[J].中國醫(yī)藥導報，2014，11(12)：60-63.

[11] 張連國，徐海濤，張慶廣，等.促紅細胞生成素及其受體在肺癌組織中的表達[J].濱州學院學報，2013，36(3)：169-171.

[12] 俞婷婷，單莉，韓志剛.非小細胞肺癌組織中促紅細胞生成素及其受體mRNA的表達及意義[J].臨床腫瘤學雜志，2013，18(3)：203-206.

[13] 任瀟毅，柯其廣，牛躍平.促紅細胞生成素及其受體在直腸癌中表達及臨床意義[J].中華實用診斷與治療雜志，2011，25(1)：48-51.

[14] 武東輝，李勁松，李海剛，等.舌鱗癌紅細胞生成素及其受體的表達和臨床意義[J].中華口腔醫(yī)學研究雜志(電子版)，2010，4(1)：56-62.

[15] 陳光華，周鐵，許傳亮，等.促紅細胞生成素和受體在前列腺癌組織中共同過表達的研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2012，12(36)：7070-7076.

(本文編輯薛妮)

Effects of Erythropoietin on the Activity of Proliferation，Apoptosis and Migration of Glioma U251 Cells

Huge Jile，Shi Yunping，Xue Dongli，Lan Haixia

The Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010051，Inner Mongolia， China

Lan Haixia (The 253 Hospital of the People’s Liberation Army， Hohhot，Inner Mongolia， China)

Objective To investigate the effects of erythropoietin (EPO) on the activity of proliferation，apoptosis and migration of glioma U251 cells. Methods The glioma U251 cells were cultured in vitro and optimal concentration of EPO was screened with MTT.Then glioma U251 cells were divided into negative control group and the experimental group (EPO optimum concentration for the experimental group). The proliferation，migration，invasion and apoptosis capability of glioma U251 cells were detected by cloning experiments，scratch test，transwell experiment and the cells flow cytometry. Results The result of MTT was that the optimal concentration of EPO was 300 IU/mL.The cloning experiment showed that the level of cell proliferation was increased.The result of the scratch test showed that cell migration was increased.Transwell experiment showed the capacity of cell invasion was increased.The cell flow cytometry showed that the ability of apoptosis was reduced.Conclusion The experimentally derived EPO could promote the proliferation， migration and invasion，and inhibit the apoptosis of glioma U251 cells. It could be seen the EPO had a protective effect on nerve cells. It provided a new way and theoretical basis for the intervention in the early of neonatal brain injury in clinical.

erythropoietin； neuroprotection； proliferation；apoptosis；migration

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院(呼和浩特 010051)；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學；3.解放軍第253醫(yī)院

蘭海霞，E-mail：hugejilesj@163.com

R331.3 R741

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.02.013

1672-1349(2017)02-0170-04

2016-09-25)

引用信息：呼格吉樂，石蕓萍，薛東力，等.非糖尿病與糖尿病主動脈夾層病人發(fā)生自主神經(jīng)病變的對比研究[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2017，15(2)：170-173.