王 永，施 丹，蔡琦霞，李志朋，李 娥，陳美華

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

健心顆粒對慢性心力衰竭大鼠CaN mRNA、UⅡRNA表達(dá)的影響

王 永，施 丹，蔡琦霞，李志朋，李 娥，陳美華

目的 探討健心顆粒不同劑量對慢性心力衰竭大鼠鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN) mRNA、尾加壓素Ⅱ(UⅡ)RNA表達(dá)的影響。方法 將18周齡的自發(fā)性高血壓大鼠64只隨機分為培哚普利組、健心顆粒等劑量組、健心顆粒高劑量組、陰性對照組，每組16只。培哚普利組培哚普利0.36 mg/(kg·d)灌胃、健心顆粒等劑量組、健心顆粒高劑量組分別以健心顆粒3.2 g/(kg·d)、6.1 g/(kg·d)灌胃；陰性對照組予生理鹽水，按1 mL/100 g灌胃給藥，每日兩次。給藥后第21天、第35天各組分別處死8只大鼠，采用熒光定量PCR檢測心室肌組織CaN mRNA、UⅡRNA表達(dá)。結(jié)果 第21天與陰性對照組比較，培哚普利組CaN mRNA ，健心顆粒等劑量組、健心顆粒高劑量組大鼠心室肌組織CaN mRNA、UⅡRNA表達(dá)均顯著下降，且健心顆粒高劑量組明顯低于健心顆粒等劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；第35天，與陰性對照組比較，其他各組大鼠心室肌組織CaN mRNA、UⅡRNA的表達(dá)均顯著下降，且培哚普利組<健心顆粒等劑量組<健心顆粒高劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 健心顆粒能減少UⅡ、CaN基因表達(dá)，可顯著抑制心室重構(gòu)。

慢性心力衰竭；健心顆粒；自發(fā)性高血壓大鼠；鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶；尾加壓素Ⅱ

慢性心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的基本機制是心室重構(gòu)，是由一系列復(fù)雜的分子和細(xì)胞機制引起心肌結(jié)構(gòu)、功能和表型[1]的改變。目前已明確交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)等神經(jīng)、體液過度激活引起心室重構(gòu)，應(yīng)用β受體阻滯劑及拮抗RAAS藥物可延緩心力衰竭進(jìn)展，但不能完全逆轉(zhuǎn)。研究顯示[2-5]，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)參與諸如血管緊張素Ⅱ、醛固酮、內(nèi)皮素等多種刺激因素引起的心肌肥大，可致心室重塑。研究表明[6]，尾加壓素Ⅱ(UⅡ)可增加細(xì)胞內(nèi)CaN濃度。研究發(fā)現(xiàn)[7]，15周齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)跟同齡正常血壓大鼠(WKY)大鼠比較，血漿及心臟腦鈉素(BNP)顯著增高，說明已發(fā)生心力衰竭。本實驗采用18周齡SHR大鼠作為心力衰竭的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 自發(fā)性高血壓大鼠64只，雄性15周～18周齡，合格證號2007000575411，由福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 實驗藥物 健心顆粒：黃芪333 g，紅參 167 g，丹參 167 g，豬苓 167 g，白術(shù)167 g，葶藶子167 g，蒲黃100 g，桂枝100，加水沒藥浸泡1 h，第2次煎煮1.5 h，第2、3次各煎煮1 h，濾液合并濃縮制成清膏并干燥成顆粒1 000 g，分裝，每袋10 g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院制劑室提供，批號：z20100010。培哚普利，每片4 mg[施維雅(天津)制藥有限公司生產(chǎn)，批號：H20034053]。

1.3 實驗試劑及儀器設(shè)備 CaN mRNA、UⅡRNA的Q-PCR試劑盒，購自Vazyme公司。-80 ℃超低溫冰箱，型號SANYO MDF-U73V(三洋)，高速冷凍離心機，型號Eppendorf 5417R，德國生產(chǎn)。漩渦震蕩儀，型號Eppendorf ThermoMixer C，德國生產(chǎn)。分光光度儀，型號Thermo NanoDrop 2000，美國生產(chǎn)?；驍U增儀，型號Applied Biosystems 9700 PCR System。美國生產(chǎn)。凝膠成像儀，型號Biorad GelDoc XR。水平電泳儀，型號Bio-Rad。熒光定量PCR儀，型號ABI 7500 Real-Time PCR System。

1.4 動物分組及處理 將18周齡的自發(fā)性高血壓大鼠64只隨機分為培哚普利組、健心顆粒等劑量組、健心顆粒高劑量組、陰性對照組，每組16只。參照等效劑量法培哚普利組予培哚普利0.36 mg/(kg·d)灌胃，健心顆粒等劑量組、健心顆粒高劑量組分別予健心顆粒3.2 g/(kg·d)、6.1 g/(kg·d)灌胃，陰性對照組予生理鹽水。按1 mL/100 g灌胃給藥，每天2次，實驗過程35 d。

1.5 實驗方法

1.5.1 引物合成 美國life公司合成。其引物序列如下，β-actin引物：上游5’CGGTCAGGTCATCACTATCG’3；下游5’CTGTGTTGGCATAGAGGTCTT’3。CaN引物：CaN上游TATGACGCCTGTATGGATGC；CaN下游：CCTGACTGTGTTGTGAGTGA。引物：UⅡ上游5’GGCAAGATTCTAACACTGTACTGAG’3；下游5’GTTTCCTGAAGTGATGGTTCTGAG’3。

1.5.2 觀察指標(biāo)及方法 分別于灌胃后第21天、第35天每組隨機抽取8只大鼠，以水合氯醛麻醉，取心室肌組織100 mg，液氮充分研磨，加入1 mL Trizol(Invitrogen)溶液，勻漿，震蕩混勻，室溫裂解5 min～15 min，加氯仿0.2 mL震蕩混勻，室溫放置5 min～15 min，4 ℃12000 r/min離心，15 min，轉(zhuǎn)上層水相(400 μL～500 μL)于另一干凈1.5 mL EP管中，加等體積異丙醇(400 μL～500 μL)，混勻后-20 ℃中15 min～30 min，4℃ 12 000 r/min離心，15 min，棄上清，加75%乙醇1 mL，4 ℃ 7 500 r/min離心，5 min，棄上清，超凈工作臺開風(fēng)機干燥約30 min，1.1%瓊脂糖凝膠，以溴化乙啶染色，凝膠電泳，檢測總RNA質(zhì)量。取1 μg總RNA于PCR管中，65 ℃條件下放置5 min，立即置于冰上至少1 min，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將反轉(zhuǎn)錄CDNA按照以下反應(yīng)體系進(jìn)行擴增：RT-qPCR反應(yīng)體系：2×rTaq PCR SuperMix 10 μL，上游引物(10 μmol/L)0.8 μL，下游引物(10 μmol/L)0.8 μL，CDNA1 μL，雙蒸水7.8 μL，總體積20 μL；反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃、5 min；變性94 ℃、30 s；退火60 ℃、30 s，30個循環(huán)(72 ℃收集熒光)。熒光定量檢測，按照上述反應(yīng)條件制備擴增曲線，ΔCT=同一個組目的基因CT值平均值-內(nèi)參CT值平均值；ΔΔCT=其他組ΔCT-參考組ΔCT；RQ值=2-ΔΔCT，RQ值代表基因相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心室肌CaN mRNA表達(dá)比較 第21天，與陰性對照組比較，培哚普利組CaN mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；其他兩組大鼠心室肌CaN mRNA表達(dá)均顯著下降，且健心顆粒高劑量組明顯低于健心顆粒等劑量組(P<0.05)。第35天，與陰性對照組比較，其他各組大鼠心室肌CaN mRNA的表達(dá)均顯著下降，且培哚普利組<健心顆粒等劑量組<健心顆粒高劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

組別第21天第35天陰性對照組1.17±0.161.11±0.10培哚普利組1.08±0.141)0.89±0.061)健心顆粒等劑量組0.82±0.051)0.42±0.031)2)健心顆粒高劑量組0.52±0.051)3)0.24±0.041)2)3) 與陰性對照組進(jìn)行比較,1)P<0.05;與培哚普利組比較,2)P<0.05;與健心顆粒等劑量組比較,3)P<0.05。

2.2 各組大鼠心室肌UⅡRNA表達(dá)量比較 第21天，與陰性對照組比較，培哚普利組表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其他兩組大鼠心室肌UⅡRNA的表達(dá)均顯著下降，且健心顆粒高劑量組明顯低于健心顆粒等劑量組(P<0.05)；第35天，與陰性對照組比較，其他各組大鼠心室肌UⅡRNA的表達(dá)均顯著下降，且培哚普利組<健心顆粒等劑量組<健心顆粒高劑量組(P<0.05)。詳見表2。

組別第21天第35天陰性對照組0.98±0.030.98±0.02培哚普利組0.92±0.051)0.71±0.071)健心顆粒等劑量組0.64±0.041)0.48±0.011)2)健心顆粒高劑量組0.37±0.041)3)0.25±0.021)2)3) 與陰性對照組進(jìn)行比較,1)P<0.05;與培哚普利組比較,2)P<0.05;與健心顆粒等劑量組比較,3)P<0.05。

3 討 論

CaN是迄今唯一受Ca2+/鈣調(diào)素(CaM)調(diào)節(jié)的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，其活性由CaM結(jié)合CaNA、Ca2+結(jié)合CaNB共同調(diào)節(jié)。CaNB結(jié)構(gòu)與CaM相似。而CaNA分為：CaNAα、CaNAβ、CaNAγ三種亞型，其中參與心肌重構(gòu)的是CaNAβ[8]。近來研究發(fā)現(xiàn)，CaN在心肌重構(gòu)中發(fā)揮重要作用，心肌重構(gòu)包括細(xì)胞重構(gòu)、組織重構(gòu)、電重構(gòu)、功能重構(gòu)，功能重構(gòu)是其他三方面改變的外在功能體現(xiàn)[9-10]。心肌肥厚是心室重構(gòu)的過程之一，主要表現(xiàn)為細(xì)胞增大、間質(zhì)細(xì)胞增生、胞外基質(zhì)重構(gòu)及胚胎基因再表達(dá)，此為心臟在各種體內(nèi)外刺激因素作用下發(fā)生的一種代償性反應(yīng)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，CaN可通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄階段，從而參與心肌肥厚形成[11-12]。

UⅡ是一種生長抑素類似的環(huán)狀血管收縮肽，是目前發(fā)現(xiàn)人體最強的縮血管物質(zhì)[13]，其通過刺激G蛋白偶聯(lián)受體-UⅡ受體而調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)。大量研究表明，UⅡ在心肌肥大、心肌纖維化等進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，與心室重塑進(jìn)展密切相關(guān)[14]。研究證實[15]，心力衰竭病人血漿UⅡ水平顯著高于正常人，且升高與心力衰竭嚴(yán)重程度相關(guān)，與心功能分級呈顯著正相關(guān)，提示血漿UⅡ含量與心力衰竭病情嚴(yán)重程度表現(xiàn)相關(guān)。李巍等[16]發(fā)現(xiàn)，UⅡ可通過激活CaN通路引起心肌肥大，導(dǎo)致心室重塑。

健心顆?；谛年枤馓?、血瘀水停為主要病理改變而制成，其組方如下：黃芪333 g，紅參、丹參、豬苓、白術(shù)、葶藶子各167 g，蒲黃、桂枝各100 g。方中以黃芪、紅參為君，取其益氣溫陽之功，以治其本，臣以蒲黃、丹參活血化瘀，疏通血脈，再配以桂枝、豬苓溫陽化飲利水，白術(shù)健脾燥濕利水，葶藶子宣肺利水?，F(xiàn)代藥理研究證明，配方紅參有大補元氣，固脫復(fù)脈，有顯著強心、擴張冠狀動脈的作用；黃芪是中醫(yī)治療心氣虛證的益氣溫陽藥典型代表，其作用機制與影響心肌肌漿網(wǎng)鈣泵基因表達(dá)，通過酶實現(xiàn)改善心功能關(guān)系密切，且以改善舒張功能為主[17]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)使用利尿藥降低前負(fù)荷，活血藥可擴張血管，改善血液循環(huán)，二者合用，減輕心臟前后負(fù)荷，從而增加心肌收縮能力，提高心功能，且減慢心率，降低氧耗。而以上諸藥相伍，可達(dá)到益氣活血，溫陽利水之功。前期臨床研究顯示，健心顆?？擅黠@改善心功能[18]。本研究顯示：健心顆粒能減少UⅡ、CaN的基因表達(dá)，具有顯著抑制心室重構(gòu)作用，優(yōu)于培哚普利。

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(本文編輯薛妮)

Effects of Jianxin Granules on the Expressions of Calcineurin mRNA and Urotensin Ⅱ RNA in Rats with Chronic Heart Failure

Wang Yong，Shi Dan，Cai Qixia，Li Zhipeng，Li E，Chen Meihua

The Affiliated Second Hospital，F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350001，F(xiàn)ujian，China

Objective To investigate the effects of Jianxin granules (JXG)on the expressions of calcineurin (CaN) mRNA and urotensin Ⅱ (UⅡ) RNA in rats with chronic heart failure (CHF). Methods Sixty-four 18-week-old spontaneously hypertensive rats (SHR) were randomly divided into 4 groups：perindopril group (n=16) intragastric administrated by perindopril 0.36 mg/(kg·d)， JXG low dose group (n=16)intragastric administrated by 3.2 g/(kg·d)， JXG high dose group (n=16) intragastric administrated by JXG 6.4 g/(kg·d)， and negative control group (n=16)given saline solution. After administration of the 21st day， 35th day， 8 rats in each group were sacrificed. The expressions of CaN mRNA and UⅡ RNA were detected by fluorescence quantitative PCR. Results Compared with negative control group，the expressions of CaN mRNA and UⅡ RNA significantly declined at 21st day in JXG groups，which was lower in JXG high dose group than that in JXG low dose group (P<0.05). Compared with negative control group，the expressions of CaN mRNA and UⅡ RNA significantly declined at 35th day in JXG groups and perindopril group，which was lower in JXG groups than that in perindopril group，and was lower in JXG high dose group than that in JXG low dose group (P<0.05). Conclusion JXG can reduce the expressions of CaN mRNA and UⅡ RNA，and inhibit ventricular remodeling in SHR.

chronic heart failure； Jianxin granules； spontaneously hypertensive rats； calcineurin； urotensin Ⅱ

福建省衛(wèi)生和計劃生育委員會中醫(yī)處課題(No.wzln201304)

福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院(福州 350001)，E-mail：wyong2014@163.com

引用信息：王永，施丹，蔡琦霞，等.健心顆粒對慢性心力衰竭大鼠CaNmRNA、UⅡRNA表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(2)：158-161.

R541.6 R289.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.02.009

1672-1349(2017)02-0158-04

2016-11-25)