郎 涵，魏 嵋，汪 靜，米紹平，王曉棟，陳柚伶，李 志

(1.西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院脾胃內(nèi)科，四川瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院肝膽內(nèi)科，四川瀘州 646000)

論著·基礎(chǔ)研究

葛黃顆粒對(duì)酒精性肝病模型大鼠的防治作用*

郎 涵1，2，魏 嵋3，汪 靜3，米紹平3，王曉棟3，陳柚伶1，2，李 志2△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院脾胃內(nèi)科，四川瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院肝膽內(nèi)科，四川瀘州 646000)

目的 通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察葛黃顆粒對(duì)酒精性肝病(ALD)模型大鼠的防治作用。方法 SD大鼠分為6組：正常組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、對(duì)照組，每組18只。除正常組給予蒸餾水和普通飼料外，其余各組均給予40%乙醇(1.0 mL·100 g-1·d-1)灌胃，隔日給予高脂飼料。4周后高、中、低劑量組加用不同劑量的葛黃顆粒，對(duì)照組加用美他多辛，持續(xù)8周。用蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肝臟組織的病理形態(tài)學(xué)改變，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)，用比色法測(cè)定肝組織的TG、TC；結(jié)果 在模型組中，血清AST、ALT、TG、TC水平，肝組織中的TG、TC水平顯著升高(P<0.05)；干預(yù)后，上述指標(biāo)在高劑量組和對(duì)照組中的表達(dá)明顯降低(P<0.05)；中、低劑量組降低不明顯(P>0.05);高劑量組和對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；結(jié)論 葛黃顆粒對(duì)ALD有較好的防治作用。

肝疾病，酒精性；葛花；葛黃顆粒；防治作用

酒精性肝病(ALD)是長(zhǎng)期大量飲酒所導(dǎo)致的一系列相關(guān)的肝臟疾病，包括輕癥酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化。ALD在西方發(fā)達(dá)國(guó)家是導(dǎo)致肝硬化的首要病因[1]，在我國(guó)已是繼病毒性肝炎之后的第二大肝臟疾患，給個(gè)人、家庭及社會(huì)帶來(lái)了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)?，F(xiàn)今ALD的治療方法除戒酒外，其他有效的治療方法和藥物較少，因此急需研發(fā)有效治療ALD的新藥。本研究模擬當(dāng)前人類生活狀況，采用酒精與高脂飼料喂養(yǎng)建立大鼠ALD模型，觀察葛黃顆粒對(duì)ALD模型大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠108只，雌雄各半，質(zhì)量(200±20)g，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 藥物 葛黃顆粒：由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，處方組成：葛花、趕黃草、虎杖、白術(shù)、柴胡、丹參、枳椇子、甘草等，規(guī)格：每袋10.0 g。美他多辛片由山東齊都藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：每顆0.5 g。

1.1.3 主要試劑 無(wú)水乙醇，購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠；高脂飼料(2%膽固醇+1%豬油)，購(gòu)自成都達(dá)碩生物科技有限公司；戊巴比妥鈉，購(gòu)自江西漣水制藥有限公司；蘇木精-伊紅(HE)染液，肝功酶試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；三酰甘油(TG)測(cè)試盒，總膽固醇(TC)測(cè)試盒,購(gòu)自浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 造模與給藥 模型組，高、中、低劑量組和對(duì)照組給予40%乙醇灌胃(1.0 mL·100 g-1·d-1)，每天1次，同時(shí)，隔天給予高脂飼料，正常組給予相同容積蒸餾水灌胃和普通飼料。每天20：00后禁食，次日上午空腹灌胃后開始進(jìn)食。每周稱體質(zhì)量1次，并根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量。4周后高、中、低劑量組加用不同劑量的葛黃解酒顆粒，給藥劑量依次為5.300、2.650、1.325 g·kg-1· d-1，對(duì)照組加用美他多辛，給藥劑量為0.090 g·kg-1·d-1，單次灌胃體積均為0.5 mL/100 g，每天灌胃1次。持續(xù)給藥8周后，抽取3只模型組大鼠，病理檢查證實(shí)ALD已經(jīng)形成，停止給藥。

1.2.2 標(biāo)本采集 末次給藥后禁食12 h，不禁水，次日上午稱質(zhì)量后，予以2%戊巴比妥鈉0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心留血清，-20 ℃冰箱保存，用于血清門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、TG、TC檢測(cè)。頸椎脫臼處死大鼠迅速剖取肝臟，稱取肝臟濕質(zhì)量后，從每只大鼠肝臟的相同部位取2 g經(jīng)4%中性甲醛固定，用于HE染色。

1.2.3 觀測(cè)指標(biāo)及方法 肝臟指數(shù)=肝濕質(zhì)量/末次體質(zhì)量×100%。肝組織病理學(xué)變化：肝臟組織病理學(xué)切片，HE染色，光鏡下觀察肝細(xì)胞脂肪變性程度。血清各指標(biāo)檢測(cè):按肝功酶試劑盒及血清試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定AST、ALT，血清TG、TC。肝組織各指標(biāo)的測(cè)定:按TG測(cè)試盒、TC測(cè)試盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1 肝臟大體解剖學(xué)情況 正常組大鼠的肝臟呈紅褐色，包膜光滑，邊緣銳利，質(zhì)地適中。模型組大鼠腹腔肥大，脂肪組織豐富，肝臟顏色呈磚紅色或黃褐色，體積增大，包膜緊張，切面油膩，可見黃色脂肪泡，呈脂肪肝外觀。4個(gè)用藥組介于正常與模型組之間，其中高劑量組與對(duì)照組肝臟外觀接近正常組。

2.2 肝臟指數(shù)的比較 與正常組[(2.57±0.15)%]相比，模型組[(2.89±0.24)%]的肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)，高劑量組[(2.61±0.21)%]和對(duì)照組[(2.68±0.21)%]肝臟指數(shù)也均有一定范圍地增高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，高、中、低劑量組[低劑量組：(2.80±0.48)%；中劑量組：(2.77±0.45)%]的肝臟指數(shù)均有不同程度的降低，其中高劑量組降低顯著(P<0.05)。高劑量組的肝臟指數(shù)比對(duì)照組更低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 大鼠肝組織HE染色結(jié)果顯示 正常組：肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，邊界清楚，沿匯管區(qū)呈放射狀整齊排列。模型組：肝細(xì)胞顯著腫大，邊界模糊，細(xì)胞質(zhì)中充滿大小不等的脂肪空泡，少數(shù)細(xì)胞核被擠到一邊，肝細(xì)胞索紊亂，肝竇及匯管區(qū)未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。低劑量組：組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)不明顯，肝細(xì)胞腫大，細(xì)胞索紊亂，細(xì)胞質(zhì)中可見明顯脂肪空泡。中劑量組：肝細(xì)胞內(nèi)的脂肪空泡較低劑量組減少，且以小脂肪泡為主，但肝細(xì)胞仍有腫大，肝臟總體結(jié)構(gòu)恢復(fù)不理想。高劑量組：肝細(xì)胞索恢復(fù)放射排列，大部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)已經(jīng)恢復(fù)正常，僅少數(shù)細(xì)胞輕度腫大，可見少量的微小脂肪空泡。對(duì)照組：肝臟結(jié)構(gòu)恢復(fù)接近于正常，肝細(xì)胞呈放射狀排列，細(xì)胞質(zhì)中基本不見脂肪空泡，見圖1、2。

A:正常組；B:模型組；C:低劑量組；D:中劑量組；E:高劑量組；F:對(duì)照組。

圖1 各組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度(HE，×200)

A:正常組；B:模型組；C:低劑量組；D:中劑量組；E:高劑量組；F:對(duì)照組。

圖2 各組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度(HE，×400)

2.4 大鼠血清各指標(biāo)比較 模型組的AST、ALT、TG、TC的水平均較正常組顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，高、中、低劑量組AST、ALT、TG、TC的水平呈現(xiàn)出隨著劑量增加而遞減的趨勢(shì)，并且4項(xiàng)指標(biāo)在高劑量組和模型組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高劑量組AST、ALT、TG、TC的水平已接近于正常組；對(duì)照組AST、ALT、TG、TC的水平也顯著低于其在模型組的水平(P<0.05)。高劑量組與對(duì)照組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清AST、ALT、TG、TC 比較

a:P<0.05,與正常組比較；b:P<0.05，與模型組比較。

2.5 大鼠肝組織TG、TC的比較 模型組大鼠TG、TC的水平均顯著高于正常組(P<0.05)。與模型組相比，對(duì)照組大鼠TG、TC的水平均顯著降低(P<0.05)。高、中、低劑量組TG、TC的水平較模型組均不同程度降低，其中高劑量組下降顯著(P<0.05)。各項(xiàng)指標(biāo)在高劑量組和對(duì)照組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，并且兩項(xiàng)指標(biāo)在兩組的水平與正常組均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠肝組織TG、TC比較

a:P<0.05,與正常組比較；b:P<0.05，與模型組比較。

3 討 論

ALD的致病因子早已明確，即大量飲酒，且飲酒量、飲酒時(shí)間與肝臟損傷程度呈正相關(guān)[2-3]，大量研究表明無(wú)論肝臟損傷嚴(yán)重程度如何，ALD患者最基本的治療始終都是戒酒[4]。除此之外，ALD患者需要良好的營(yíng)養(yǎng)支持，在戒酒的基礎(chǔ)上必須提供高蛋白、低脂飲食，同時(shí)補(bǔ)充葉酸及各類維生素也是十分必要的[5]。目前對(duì)ALD的治療除戒酒外確切有效的治療方法及藥物較少，所以，急需研究新的防治ALD的藥物及方案。 國(guó)內(nèi)較多實(shí)驗(yàn)證實(shí)中醫(yī)藥在治療ALD方面取得了較好的療效，有著廣闊的應(yīng)用前景[6-12]。西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院全國(guó)著名老中醫(yī)、肝病專家孫同郊教授尋求古籍，博采眾家之長(zhǎng)，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)ALD發(fā)病機(jī)制的研究成果，認(rèn)為該病由“酒”所致，而酒性濕熱有毒，易傷肝脾，提出中醫(yī)在治療ALD時(shí)“解酒毒”、“護(hù)肝脾”是關(guān)鍵。經(jīng)過(guò)多年的臨床實(shí)踐，總結(jié)出了“葛黃解酒方”這一治療ALD的有效經(jīng)驗(yàn)方，現(xiàn)經(jīng)現(xiàn)代工藝制成顆粒劑藥物“葛黃顆粒”。葛黃顆粒組成藥物有：葛花、趕黃草、虎杖、白術(shù)、柴胡、丹參、枳椇子、甘草等。其中，葛花醒脾解酒為君藥；白術(shù)健脾利濕，柴胡疏肝為臣藥；丹參活血化瘀散結(jié)，虎杖、趕黃草分利大小便、清熱解毒，除煩止渴，枳椇子解酒毒，利大小便，除煩止渴共為佐藥；甘草調(diào)和藥性為使藥。全方共同體現(xiàn)“醒酒解毒、健脾疏肝、清熱利濕”之功，完全體現(xiàn)了中醫(yī)“酒毒濕熱致使肝脾腎三臟器功能失調(diào)是ALD發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵”的觀點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)從肝臟指數(shù)、肝臟病理學(xué)改變、血清酶學(xué)、血脂及肝脂5個(gè)方面探討葛黃顆粒對(duì)ALD模型大鼠的保護(hù)作用。(1)肝臟指數(shù)反映了肝臟受損的情況，ALD模型大鼠的肝臟從肉眼觀察大而軟。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出葛黃顆粒對(duì)肝臟指數(shù)的降低程度為高、中、低的順序，說(shuō)明其對(duì)肝臟指數(shù)的作用在所選取的范圍內(nèi)存在量效依賴趨勢(shì)。(2)從肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察說(shuō)明模型復(fù)制成功。所有用藥組大鼠肝細(xì)胞脂肪變均得到不同程度的改善，說(shuō)明葛黃顆粒能夠改善ALD模型大鼠的肝臟病理改變。(3)血清酶學(xué)方面，乙醇進(jìn)入體內(nèi)，其代謝過(guò)程可生成活性氧，活性氧既可損傷線粒體又可損傷細(xì)胞膜，從而使轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)入血內(nèi)，故血中的轉(zhuǎn)氨酶升高[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示葛黃顆粒具有保肝降酶的作用，且在所選劑量范圍內(nèi)，保肝降酶作用與劑量呈正相關(guān)。(4)正常情況下，脂肪是以乳糜微粒(CM)的形式經(jīng)腸系膜吸收進(jìn)入血液循環(huán)，再運(yùn)送至肝臟、脂肪組織，形成TG[14]。TC作為血液中所有脂蛋白的膽固醇之和，與脂肪代謝關(guān)系密切，能夠反映脂代謝狀況。因此，血清中的TG、TC水平可以反映患ALD的危險(xiǎn)度以及病理程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示葛黃解酒顆粒具有較好的降血脂作用。最后，肝臟是機(jī)體合成TG、TC的主要場(chǎng)所，但正常情況下并不儲(chǔ)存。乙醇及其代謝產(chǎn)物能夠促使TG的合成增加，轉(zhuǎn)運(yùn)減少，引起脂肪沉淀于肝細(xì)胞內(nèi)。所以監(jiān)測(cè)肝組織中的TG、TC水平較血清TG、TC的水平能更直接、準(zhǔn)確地反映肝脂質(zhì)代謝情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示模型組大鼠肝臟已有明顯脂肪堆積，模型復(fù)制成功，葛黃顆粒和美他多辛均有較好的降肝脂作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示葛黃顆?？梢越档虯LD模型大鼠的肝臟指數(shù)、血脂及肝脂，改善肝功能，減輕肝臟損傷，說(shuō)明其對(duì)ALD有防治的作用。

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Preventive and treatment effect of Gehuang granules on ALD model rats*

LangHan1,2，WeiMei3，WangJing3，MiShaoping3，WangXiaodong3，ChenYouling1,2，LiZhi2△

(1.CollegeofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;2.DepartmentofSpleenandStomachInternalMedicine,AffiliatedHospitalofTraditionalChineseMedicine,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;3.DepartmentofHepatobiliaryInternalMedicine,AffiliatedHospitalofTraditionalChineseMedicine,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To observe the preventive and treatment effect of Gehuang granules(GHG) on alcohol liver disease(ALD) model rats by the animal experiment.Methods SD rats were randomly divided into 6 groups:normal group,model group,low dose group,middle dose group,high dose group,control group，18 in each group.Except the normal group was given distilled water and common fodder,the rest groups were given 40% alcohol by gavage (1.0 mL·100 g-1·d-1) and supplemented with high fat fodder on every other day.Four weeks later,the low,middle and high doses groups were added with different doses of GHG.The control group was added with metadoxine.The intervention persisted for 8 weeks.The histopathological morphology change of liver tissue was observed by HE staining.Serum AST,ALT,TG and TC were detected by the automatic biochemical analyzer.The TG and TC level in liver tissue was detected by the colorimetric method.Results The model group showed significantly increased levels of serum AST,ALT,TG,TC and levels of TG and TC in liver tissue(P<0.05)；after intervention,the expressions of above indexes in the high dose group and control group were markedly decreased(P<0.05),but the decrease in the middle dose and low dose groups were unapparent (P>0.05); the difference between the high dose and control group had no statistical significance(P>0.05).Conclusion GHG has better preventive and treatment effect on ALD.

liver disease,alcoholic;pueraria flower;Gehuang granules；preventive and treatment effect

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.03.006

四川省科技廳課題(2013SZ0148)；瀘州市科技局課題(2013LZLY-J24)。 作者簡(jiǎn)介：郎涵(1990-)，住院醫(yī)師，在讀碩士，主要從事消化系統(tǒng)疾病方面研究?！?/p>

R575.1

A

1671-8348(2017)03-0305-03

2016-07-19

2016-09-07)