李 程，夏紀(jì)毅，萬(wàn) 沁

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川瀘州 646000；2.重慶市榮昌區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科 402460；3.西南醫(yī)科大學(xué)藥物與功能性食品研究中心，四川瀘州 646000)

論著·基礎(chǔ)研究

Nrf2/ARE通路與PI3K/AKT通路相互作用對(duì)胰島細(xì)胞半胱天冬酶-3表達(dá)的影響*

李 程1,2，夏紀(jì)毅3，萬(wàn) 沁1△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川瀘州 646000；2.重慶市榮昌區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科 402460；3.西南醫(yī)科大學(xué)藥物與功能性食品研究中心，四川瀘州 646000)

目的 探討核因子相關(guān)因子2(Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)通路與磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路相互作用對(duì)2型糖尿病(T2DM)大鼠胰島細(xì)胞凋亡和半胱天冬酶-3(Caspase-3)蛋白表達(dá)的影響及其可能機(jī)制。方法 將60只雄性Wistar大鼠分為正常對(duì)照組(NC組，n=20)、糖尿病模型組(DM組，n=20)和叔丁基對(duì)苯二酚干預(yù)組(tBHQ組，n=20)，干預(yù)8周后處死所有大鼠，TUNEL檢測(cè)胰島細(xì)胞凋亡，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清及胰腺組織中丙二醛(MDA)水平，Western blot檢測(cè)AKT、p-AKT、總Nrf2、核Nrf2、血紅素氧合酶1(HO-1)、Caspase-3在胰島細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與NC組比較，DM組胰島細(xì)胞凋亡率顯著增加(P=0.000)，而tBHQ組胰島細(xì)胞凋亡率明顯低于DM組(P=0.000)。DM組血清及胰腺組織中MDA水平較NC組明顯升高(P=0.000)，而tBHQ組血清及胰腺組織中MDA水平明顯低于DM組(P=0.000)。DM組p-AKT、總Nrf2、核Nrf2及HO-1蛋白的表達(dá)水平均較NC組顯著降低(P=0.000)，Caspase-3蛋白表達(dá)水平較NC組明顯升高(P=0.000)；與DM組比較，tBHQ組p-AKT、總Nrf2、核Nrf2及HO-1蛋白的表達(dá)水平均明顯增加(P=0.000)，Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P=0.017)；AKT蛋白表達(dá)水平在3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 Nrf2/ARE通路與PI3K/AKT通路相互作用對(duì)抑制胰島細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)及延緩胰島細(xì)胞凋亡進(jìn)程產(chǎn)生重要的保護(hù)作用。

半胱天冬酶-3；糖尿病，2型；胰島；細(xì)胞凋亡；Nrf2/ARE通路；PI3K/AKT通路；氧化性應(yīng)激

磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(serine/threonine protein kinase,AKT)通路已被證明在調(diào)控胰島細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著重要作用。Li等[1]研究發(fā)現(xiàn)，人胰島淀粉樣多肽(human islet amyloid polypeptide,hIAPP)聚集可導(dǎo)致2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)胰島B細(xì)胞損傷、凋亡，這與氧化應(yīng)激對(duì)PI3K/AKT通路的抑制作用不斷增強(qiáng)，進(jìn)而激活重組人半胱天冬酶-3、8、9(Caspase-3,8,9)有關(guān)。PI3K/AKT通路調(diào)控的其中一個(gè)下游信號(hào)蛋白為核因子相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)，通過(guò)激活Nrf2，使Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant responsive element,ARE)通路誘導(dǎo)血紅素氧合酶1(hemeoxygenase-1,HO-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等抗氧化酶的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，而應(yīng)用PI3K/AKT通路特異性抑制劑處理后，則可抑制Nrf2活性[2-3]。本研究通過(guò)激活Nrf2/ARE通路，觀察對(duì)T2DM大鼠PI3K/AKT通路、Caspase-3蛋白表達(dá)及胰島細(xì)胞凋亡的影響，以探討Nrf2/ARE通路與PI3K/AKT通路相互作用對(duì)T2DM大鼠胰島細(xì)胞的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康8周齡雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～200 g，由重慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售公司提供。鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；叔丁基對(duì)苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)購(gòu)自比利時(shí)Acros公司；丙二醛(malondialdehyde,MDA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司；TUNEL試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司；總蛋白、核蛋白提取試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗大鼠Nrf2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗大鼠AKT單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；兔抗大鼠p-AKT(Ser473)多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；兔抗大鼠HO-1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司；兔抗大鼠Caspase-3單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立及分組 取60只雄性Wistar大鼠予以高糖、高脂飼料喂養(yǎng)，高糖、高脂飼料配方為普通飼料66.5%，蔗糖20.0%，豬油10.0%，膽固醇2.5%，膽酸鹽1.0%[4]。喂養(yǎng)4周后，空腹8 h，一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg BW(用前以pH 4.3的0.1 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液配成1.0%的濃度)，高糖、高脂飼料繼續(xù)喂養(yǎng)72 h后，空腹測(cè)尾靜脈血糖大于或等于16.7 mmol/L為T2DM模型建立成功，共43只大鼠造模成功，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為兩組：糖尿病模型組(DM組)20只，不用藥物干預(yù)，在高糖、高脂飼料中添加1.0%面粉；tBHQ干預(yù)組(tBHQ組)20只，參照文獻(xiàn)[5]的方法，在高糖、高脂飼料中添加1.0%tBHQ，余下的3只T2DM大鼠剔除。同時(shí)，另取20只Wistar大鼠作為正常對(duì)照組(NC組)，不用藥物干預(yù)，在普通飼料中添加1.0%面粉。3組大鼠連續(xù)干預(yù)8周后處死，穿刺心臟收集全血并離心，取血清放入-20 ℃冰箱凍存待測(cè)，收集胰腺組織，放入-80 ℃冰箱凍存?zhèn)錂z。

1.2.2 胰島細(xì)胞凋亡觀察及細(xì)胞凋亡率計(jì)算 各組胰腺組織切片采用TUNEL法檢測(cè)，操作嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。在200倍光鏡下觀察凋亡細(xì)胞核(棕黃色)和未發(fā)生凋亡的細(xì)胞核(藍(lán)色)。每張切片至少選取3～5個(gè)胰島在高倍視野(×400)下計(jì)算胰島細(xì)胞凋亡率，凋亡率=凋亡細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)×100%。

1.2.3 MDA檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血清及胰腺組織中MDA水平，測(cè)定方法按照MDA ELISA試劑盒使用說(shuō)明，取大鼠胰島數(shù)目含量最多的胰尾組織約100 mg，加入RIPA裂解緩沖液，12 000 r/min低溫離心10 min，在酶標(biāo)包被板上分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白對(duì)照孔、待測(cè)樣品孔。將50 μL標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品孔中，先后將10 μL和40 μL待測(cè)樣品稀釋液加到待測(cè)樣品孔中，空白對(duì)照孔不加任何液體。然后加入抗體工作液和酶標(biāo)抗體工作液繼續(xù)反應(yīng)，最后加入底物工作液反應(yīng)后在450 nm波長(zhǎng)處對(duì)每孔的光密度(OD)值進(jìn)行測(cè)量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值算出MDA濃度。

1.2.4 Western blot檢測(cè)目的蛋白 取大鼠胰島數(shù)目含量最多的胰尾組織約100 mg，加入RIPA裂解緩沖液，12 000 r/min低溫離心10 min，取上清液即得胰腺組織總蛋白，胰腺組織核蛋白的提取嚴(yán)格按照凱基生物核蛋白提取試劑盒說(shuō)明書操作。用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度，取等量蛋白電泳并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，室溫下封閉后，滴加AKT(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)、Nrf2(1∶800)、HO-1(1∶500)、Caspase-3(1∶1 000)一抗溶液，以及標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參GAPDH(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜后加入HRP-山羊抗兔IgG二抗溶液，室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像，Quantity-One測(cè)灰度值并分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠胰島細(xì)胞凋亡率的比較 凋亡細(xì)胞縮小，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、碎裂。DM組胰島細(xì)胞凋亡率[(26.42±6.93)%]較NC組[(7.05±2.81)%]顯著增加(P=0.000)，tBHQ組胰島細(xì)胞凋亡率[(13.62±3.77)%]較DM組明顯減少(P=0.000)，見(jiàn)圖1。

A:NC組；B：DM組；C：tBHQ組。

圖1 各組大鼠胰島細(xì)胞凋亡觀察(TUNEL，×200)

2.2 各組大鼠血清及胰腺組織中MDA水平的比較 DM組血清及胰腺組織中MDA水平較NC組明顯升高(P=0.000)，tBHQ組血清及胰腺組織中MDA水平較DM組明顯降低(P=0.000)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清及胰腺組織中MDA水平 比較

a：P<0.01，與NC組比較；b：P<0.01，與DM組比較。

2.3 各組大鼠胰腺組織AKT、p-AKT、總Nrf2、核Nrf2、HO-1和Caspase-3蛋白表達(dá)的比較 Western blot結(jié)果顯示：DM組p-AKT、總Nrf2、核Nrf2及HO-1蛋白的表達(dá)水平均較NC組顯著降低(P=0.000)，Caspase-3蛋白表達(dá)水平較NC組明顯升高(P=0.000)；與DM組比較，tBHQ組p-AKT、總Nrf2、核Nrf2及HO-1蛋白的表達(dá)水平均明顯增加(P=0.000)，Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P=0.017)；AKT蛋白表達(dá)水平在3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2、表2。

圖2 各組大鼠胰腺組織AKT、p-AKT、總Nrf2、 核Nrf2、HO-1、Caspase-3蛋白表達(dá)表2 各組大鼠胰腺組織各蛋白表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度比較±s)

組別nAKTp?AKT總Nrf2核Nrf2HO?1Caspase?3NC組40．99±0．081．36±0．221．12±0．141．01±0．090．89±0．070．54±0．04DM組40．99±0．090．50±0．04a0．58±0．05a0．48±0．07a0．58±0．05a1．32±0．21atBHQ組41．02±0．131．03±0．11b1．31±0．20b1．52±0．25b1．54±0．27b1．03±0．15bF1．23942．85836．40951．41659．63448．195P0．3350．0000．0000．0000．0000．000

a：P<0.01，與NC組比較；b：P<0.01，與DM組比較。

3 討 論

PI3K/AKT通路與Nrf2/ARE通路形成的PI3K/AKT-Nrf2/ARE通路在調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激方面發(fā)揮著重要作用[6-7]。PI3K/AKT通路在機(jī)體各組織與細(xì)胞中廣泛存在，通過(guò)抑制Caspase家族活性來(lái)調(diào)控細(xì)胞凋亡周期[8]。Caspase家族是細(xì)胞凋亡環(huán)節(jié)中的主要參與者，Caspase-3在該環(huán)節(jié)中扮演著主要角色，Caspase-3激活與過(guò)度表達(dá)均可引起細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)一步放大，最終使細(xì)胞發(fā)生凋亡[9]。

Tie等[10]通過(guò)研究氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)PI3K的亞基p85及AKT的影響發(fā)現(xiàn)，oxLDL可使p85亞硝基化，并顯著降低p-AKT/AKT比值，進(jìn)而誘導(dǎo)EPCs凋亡，這一改變可通過(guò)離體抗氧化治療逆轉(zhuǎn)，提示氧化應(yīng)激反應(yīng)可干擾PI3K/AKT通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致EPCs凋亡。根據(jù)PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路特點(diǎn)，PI3K與AKT結(jié)合后，先后將AKT的兩個(gè)位點(diǎn)(Thr308和Ser473)磷酸化，從而使AKT完全活化[11-12]，在本研究中，DM組p-AKT蛋白低表達(dá)提示其未被激活或未完全活化。同時(shí)，DM組Caspase-3蛋白表達(dá)水平上調(diào)，胰島細(xì)胞凋亡率顯著增加，說(shuō)明PI3K/AKT通路失活后對(duì)Caspase-3的抑制作用減弱，從而促使胰島細(xì)胞凋亡。由于PI3K/AKT通路可誘導(dǎo)下游靶基因Nrf2的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而使其磷酸化入細(xì)胞核與ARE結(jié)合，并上調(diào)抗氧化酶HO-1蛋白的表達(dá)，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)功能，而未磷酸化入細(xì)胞核的Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中被泛素化降解[13]。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)Nrf2、HO-1、MDA指標(biāo)來(lái)反映抗氧化應(yīng)激能力和胰島細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。結(jié)果顯示，DM組抗氧化應(yīng)激能力明顯減弱，胰島細(xì)胞處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)，證明氧化應(yīng)激可阻礙PI3K/AKT通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而PI3K/AKT通路活性降低可導(dǎo)致Nrf2激活障礙、入核減少，并促進(jìn)其被泛素化降解，從而引起Nrf2總蛋白、核蛋白表達(dá)水平均降低。由此，筆者推測(cè)，Nrf2/ARE通路活性降低或激活障礙，可下調(diào)HO-1蛋白的表達(dá)水平，導(dǎo)致PI3K/AKT通路更容易受到氧化應(yīng)激的攻擊損傷，使Caspase-3活性逐漸增強(qiáng)，如此循環(huán)往復(fù)，最終加速了胰島細(xì)胞凋亡進(jìn)程。

由于DM組Nrf2/ARE通路處于活性降低或失活狀態(tài)，據(jù)此，本研究選用Nrf2/ARE通路特異性激活劑tBHQ對(duì)T2DM大鼠進(jìn)行為期8周的干預(yù)和觀察[14]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，tBHQ組抗氧化應(yīng)激能力明顯增強(qiáng)，胰島細(xì)胞氧化應(yīng)激水平明顯降低，提示Nrf2/ARE通路被激活后，可抑制Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中被泛素化降解，增加其磷酸化入核率，進(jìn)而上調(diào)抗氧化酶表達(dá)，降低胰島細(xì)胞氧化應(yīng)激水平[15]。同時(shí)，tBHQ組AKT磷酸化水平增強(qiáng)，并伴隨著Caspase-3蛋白表達(dá)水平下調(diào)，胰島細(xì)胞凋亡率明顯降低，由此說(shuō)明激活Nrf2/ARE通路可減輕氧化應(yīng)激對(duì)PI3K/AKT通路的影響，進(jìn)而抑制Caspase-3蛋白活性，使胰島細(xì)胞凋亡明顯減少。

綜上所述，Nrf2/ARE通路通過(guò)抗氧化應(yīng)激作用，保護(hù)PI3K/AKT通路的正常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而PI3K/AKT通路可介導(dǎo)Nrf2蛋白表達(dá)，發(fā)揮Nrf2/ARE通路抗氧化應(yīng)激活性。兩者相互作用、相互滲透，對(duì)抑制胰島細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)及延緩胰島細(xì)胞凋亡進(jìn)程起著重要的保護(hù)作用。

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Effect of interact between Nrf2/ARE and PI3K/AKT pathways on Caspase-3 expression of islet cell*

LiCheng1,2,XiaJiyi3,WanQin1△

(1.DepartmentofEndocrinology,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;2.DepartmentofEndocrinology,TheRongchangDistrictPeople′sHospital,Chongqing402460,China;3.ResearchCenterforDrugandFunctionalFood,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To explore the effect and possible mechanisms of the interact between Nrf2/ARE and PI3K/AKT pathways on the islet cell apoptosis and Caspase-3 protein expression of type 2 diabetic rats.Methods Sixty male Wistar rats were randomly divided into the normal control group(NC group，n=20),diabetic model group(DM group，n=20)and tertiary-butylhydroquinone intervention group(tBHQ group，n=20).All rats were killed after eight weeks of intervention.TUNEL was used to determine islet cell apoptosis.ELISA was used to determine MDA levels in serum and pancreatic tissues,and Western blot was used to detect the protein expression levels of AKT,p-AKT,total Nrf2,nulear Nrf2,HO-1,Caspase-3 in pancreatic tissues.Results Compared with the NC group,the apoptosis rate of islet cells in the DM group was significantly increased(P=0.000).The apoptosis rate of islet cells in the tBHQ group was significantly lower than that in the DM group(P=0.000).Compared with the NC group,the MDA levels in serum and pancreatic tissue in the DM group were significantly increased(P=0.000),while the serum and pancreatic tissue levels of MDA in the tBHQ group were significantly lower than those in the DM group.The protein expression levels of p-AKT,total Nrf2,nulear Nrf2 and HO-1 in the DM group were significantly lower than those in the NC group(P=0.000),while the protein expression level of Caspase-3 was significantly higher than that in the NC group(P=0.000).The tBHQ group had significantly higher protein expressions of p-AKT,total Nrf2,nulear Nrf2 and HO-1 than the DM group(P=0.000),while the protein expression level of Caspase-3 was significantly decreased(P=0.017).AKT protein expression level had no statistically significant difference among the three groups(P>0.05).Conclusion The interact between Nrf2/ARE and PI3K/AKT pathways generates an important protective effect on inhibiting the expression of Caspase-3 in islet cell and delaying the process of islet cell apoptosis.

Caspase-3;diabetes mellitus,type 2;islets of langerhans islet;apoptosis;Nrf2/ARE pathway;PI3K/AKT pathway;oxidative stress

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.03.002

四川省教育廳科研計(jì)劃資助項(xiàng)目(15ZB0153)。 作者簡(jiǎn)介：李程(1986-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥方面研究?！?/p>

R587.1

A

1671-8348(2017)03-0292-04

2016-07-18

2016-10-16)