陳長(zhǎng)應(yīng)，朱桂紅

(江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學(xué)校,江蘇 徐州 221116 )

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黑蕎麥中花青素的提取及含量測(cè)定

陳長(zhǎng)應(yīng)，朱桂紅

(江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學(xué)校,江蘇 徐州 221116 )

建立了一種用微波提取黑蕎麥中花青素，并用高效液相色譜法測(cè)定其含量的方法。以體積分?jǐn)?shù)60%乙醇為萃取溶劑、料液比為1∶15、溫度為60℃，微波萃取15 min；以Shim-pack-vp-ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，甲醇(0.02 mol/L )-磷酸二氫鉀(用磷酸調(diào)節(jié)pH=3.0)(80∶20)為流動(dòng)相，流速為1.0 ml/min，進(jìn)樣量為10 μl進(jìn)行檢測(cè)。黑蕎麥中花青素含量在0.04～0.28 mg/ml,回歸方程具有良好的線性關(guān)系，精密度為RSD=0.76%，回收率為99.0%～100.2%。該方法簡(jiǎn)便快速，結(jié)果重現(xiàn)性好，定量準(zhǔn)確，準(zhǔn)確度、精密度高，適用于黑蕎麥中花青素的含量測(cè)定。

微波萃?。籋PLC；黑蕎麥；花青素

古代醫(yī)學(xué)《本草綱目》記載：苦蕎麥味苦、性平寒，有“實(shí)腸胃，益氣力，續(xù)精神，利耳目”的作用，能練五臟滓穢，降氣寬腸，磨積滯，消熱腫風(fēng)痛?？嗍w麥中含有豐富的花青素，現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)觀察表明，花青素具有降血糖、降血脂，增強(qiáng)人體免疫力、療胃疾、除濕解毒、治腎炎、蝕體內(nèi)惡肉的功效，對(duì)糖尿病、高血壓、高血脂、冠心病、中風(fēng)、胃病患者都有輔助治療作用[1-2]。目前，對(duì)花青素的測(cè)定方法比較多，主要有比色法和高效液相色譜法，比色法雖然較簡(jiǎn)單，但精確度和準(zhǔn)確率不高；高效液相色譜法準(zhǔn)確率較高，但精確度不太高[3-4]。雖然有關(guān)植物中花青素含量研究較多，但對(duì)黑蕎麥中花青素含量的測(cè)定研究較少，因此，我們研究微波法快速提取黑蕎麥中花青素，再用高效液相色譜法測(cè)定其含量。結(jié)果表明，該方法快速，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，可操作性強(qiáng)，適宜于黑蕎麥中花青素含量的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：LC-20AT高效液相色譜儀,SPD-20A紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器,TP150超聲波清洗機(jī),GM-0.33II真空泵(無(wú)油),MEL-204E電子分析天平,1 000 ml溶劑過(guò)濾器,HL-28多功能食品粉碎機(jī),WTS03-1微波提取器。

試劑：甲醇,HPLC 級(jí);磷酸二氫鉀,分析純;乙醇、乙醚、石油醚、二氯甲烷、三鹵甲烷、丙酮、乙腈,分析純；純凈水；純品原花青素。

1.2 溶液的配制

1.2.1 黑蕎麥樣品處理

黑蕎麥購(gòu)于超市，洗凈晾干，烘干，粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩后，裝瓶備用。

1.2.2 黑蕎麥樣品溶液的配制

稱取100 g黑蕎麥粉，置于微波萃取器中，在60℃時(shí)，按一定的料液比加入溶劑，通電，微波萃取15 min，取出，冷卻室溫后，取上清液，用0.45 μm針筒式濾膜過(guò)濾器過(guò)濾，濾液于100 ml 容量瓶中，備用[5]。

1.2.3 對(duì)照品溶液的制備

常溫下，精確稱取原花青素對(duì)照品0.010 0 g，于10 ml容量瓶中，加入甲醇溶液，定容于10 ml，搖勻，得到1 mg/ml原花青素對(duì)照品溶液。用0.45 μm 針筒式濾膜過(guò)濾器過(guò)濾，濾液于10 ml 容量瓶中備用。

1.2.4 色譜條件

色譜柱：Shim-pack-vp-ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：室溫；紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器及波長(zhǎng)：520 nm，流動(dòng)相:甲醇(0.02 mol/L)-磷酸二氫鉀(用磷酸調(diào)節(jié)pH=3.0)(80∶20)，流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl。在上述色譜條件下，花青素的保留時(shí)間約為4.5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波萃取條件的選擇

2.1.1 萃取溶劑的選擇

萃取溶劑是影響萃取效率的決定性因素。為了確定合適的萃取溶劑，選用圖中幾種常見(jiàn)溶劑作為提取溶劑[6-7]，對(duì)黑蕎麥中的花青素進(jìn)行微波輔助萃取，每種溶劑測(cè)定2次，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同溶劑的萃取效果

從圖1可知，二氯甲烷的萃取效果最好，乙醇次之，但考慮到二氯甲烷對(duì)流動(dòng)相有侵蝕的影響，因此,本試驗(yàn)選擇乙醇為萃取溶劑。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

稱取100 g黑蕎麥粉，置于微波萃取器中，在60℃時(shí)，分別加入體積分?jǐn)?shù)40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，料液比為1∶15，微波萃取15 min，取出，冷卻室溫后，HPLC分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，花青素含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大先升高后降低，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，含量達(dá)到最高。這是因?yàn)橐环矫嬉掖俭w積分?jǐn)?shù)的增大有利于有效成分的溶解，使得花青素提取率逐漸升高；但另一方面乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大，使得體系的極性降低，不利于有效成分的浸出，含量降低。因此，選擇作為萃取溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)為60%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花青素提取的影響

2.1.3 萃取時(shí)間的選擇

稱取100 g黑蕎麥粉，置于微波萃取器中，在60℃時(shí)，加入60%的乙醇溶液，料液比為1∶15，分別在5、10、15、20、25、30 min微波萃取，冷卻室溫后，HPLC分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。隨著萃取時(shí)間延長(zhǎng)，提取率越高，在15 min時(shí)達(dá)到最高值并逐漸平穩(wěn)，因此，選擇微波萃取時(shí)間15 min為宜。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)花青素提取的影響

2.1.4 料液比的選擇

稱取100 g黑蕎麥粉，置于微波萃取器中，在60℃時(shí)，加入 60%的乙醇溶液，分別在料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30情況下微波萃取15 min，冷卻室溫后，HPLC分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，料液比為1∶15時(shí)，提取率高。因此，選擇料液比為1∶15。

圖4 料液比對(duì)花青素提取的影響

2.1.5 萃取溫度的選擇

稱取100 g黑蕎麥粉，置于微波萃取器中，加入 60%的乙醇溶液，料液比為1∶15，分別在40、50、60、70、80、90℃下，微波萃取15 min，冷卻室溫后，HPLC分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，溫度升高，花青素提取率增大，但是溫度超過(guò)60℃后，提取率反而降低。溫度升高，有利于樣品中的花青素?cái)U(kuò)散到溶劑中，所以溫度升高提取率升高，但溫度高于60℃后，已超過(guò)乙醇的沸點(diǎn)，大部分乙醇以氣態(tài)存在，溶解花青素的能力下降，也可能是因?yàn)楫?dāng)溫度達(dá)到一定時(shí)，花青素發(fā)生分解或異構(gòu)變成其他物質(zhì)，最終導(dǎo)致花青素提取率下降，綜合考慮，最佳提取溫度應(yīng)在60℃[8-9]。結(jié)果如圖5所示。

圖5 萃取溫度對(duì)花青素提取的影響

2.2 流動(dòng)相的選擇

在色譜條件的優(yōu)化中，在流動(dòng)相的選擇上，分別考察了甲醇-水、甲醇-磷酸、乙睛-水、乙睛-磷酸四種流動(dòng)相。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)：甲醇(0.02 mol/L )-磷酸二氫鉀(用磷酸調(diào)節(jié)pH=3.0)(70∶30)作為流動(dòng)相時(shí)分離效果最好，分離度達(dá)到2.256。流動(dòng)相中，用磷酸將溶液調(diào)為酸性，可以改善分離度和防止峰的拖尾，并使出峰時(shí)間提前，但對(duì)保持柱的穩(wěn)定性和延長(zhǎng)柱的壽命有一定的影響[10]。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液(1 mg/ml)于10 ml 容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，進(jìn)行HPLC分析。以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖6所示。

圖6 花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為:A=1.596×107C+1.198×104，r=0.999 8。結(jié)果表明，該方法分離效果良好，質(zhì)量濃度在0.04～0.28 mg/ml時(shí)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 樣品測(cè)定

稱取100 g黑蕎麥粉，置于微波萃取器中，在60℃時(shí)，加入 60%的乙醇溶液，料液比為1∶15，通電，微波萃取15 min，取出，冷卻室溫后，取澄清濾液，用0.45 μm針筒式濾膜過(guò)濾器過(guò)濾，濾液于100 ml容量瓶中，精密吸取樣品溶液 5 ml，于100 ml容量瓶中，加入加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，每次取 10 μl， 平行5次，注入色譜儀，按1.2.4節(jié)方法中的色譜條件，記錄色譜圖，根據(jù)圖中的峰面積，代入回歸方程，測(cè)得樣品中花青素的含量為0.215 mg/ml。測(cè)定結(jié)果如圖7所示，色譜圖見(jiàn)圖8、圖9。

圖7 樣品含量測(cè)定結(jié)果

圖8 花青素標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

圖9 樣品色譜圖

2.5 精密度試驗(yàn)

稱取100 g黑蕎麥粉，置于微波萃取器中，在60℃時(shí)，按1∶15的料液比加入溶劑，通電，微波萃取15 min，取出，冷卻室溫后，取澄清濾液，用0.45 μm針筒式濾膜過(guò)濾器過(guò)濾，濾液于 100 ml 容量瓶中，精密吸取樣品溶液 5 ml，于 100 ml 容量瓶中，加入流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，量取樣品溶液10 μl，按1.2.4節(jié)方法中的色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，根據(jù)峰面積計(jì)算黑蕎麥中花青素的含量。結(jié)果如圖10所示，RSD=0.76%(n=6)，表明儀器精密度良好。

圖10 樣品精密度測(cè)定結(jié)果

2.6 回收率試驗(yàn)

稱取100 g黑蕎麥粉，置于微波萃取器中，在60℃時(shí)，按1∶15的料液比加入溶劑，通電，微波萃取15 min，取出，冷卻室溫后，取澄清濾液，用0.45 μm針筒式濾膜過(guò)濾器過(guò)濾，濾液于 100 ml 容量瓶中，備用。

精密量取上述樣品溶液5 ml，6份，放入6個(gè)100 ml容量瓶中，再分別精密量取已知含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/ml) 5 ml，6 份，放入上述6個(gè)100 ml容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，分別取10 μl，按照1.2.4節(jié)方法，注入色譜儀，記錄色譜圖，根據(jù)峰面積計(jì)算黑蕎麥中花青素的含量。測(cè)定結(jié)果如表1、圖11所示，回收率為99.0%～100.2%，RSD為0.95%。

表1 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

圖11 樣品回收率測(cè)定結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取100 g黑蕎麥粉，置于微波萃取器中，在60℃時(shí)，按1∶15的料液比加入溶劑，通電，微波萃取15 min，取出，冷卻室溫后，取澄清濾液，用0.45 μm針筒式濾膜過(guò)濾器過(guò)濾，濾液于100 ml容量瓶中，精密吸取樣品溶液5 ml，于100 ml容量瓶中，加入流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，量取樣品溶液10 μl，按照1.2.4節(jié)方法，注入色譜儀，在0、24、48、72、96 h記錄色譜圖，記錄峰面積，算出RSD值，計(jì)算結(jié)果是RSD為0.53%，表明樣品溶液中花青素在96 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果如表2所示。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取樣品溶液 5 ml，于 100 ml 容量瓶中，加入流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，量取樣品溶液10 μl，按照1.2.4節(jié)方法，注入色譜儀，平行6次，測(cè)定黑蕎麥中花青素的含量。結(jié)果是RSD=0.73%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好，詳見(jiàn)表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本試驗(yàn)選擇體積分?jǐn)?shù)60%乙醇為萃取溶劑、料液比為1∶15、溫度為60℃、微波萃取15 min的優(yōu)化條件，對(duì)黑蕎麥中的花青素進(jìn)行萃取，以Shim-pack-vp-ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱，甲醇(0.02 mol/L )-磷酸二氫鉀(用磷酸調(diào)節(jié)pH=3.0)(80∶20)為流動(dòng)相，流速為1.0 ml/min，進(jìn)樣量為10 μl進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，在 0.04～0.28 mg/ml具有良好的線性關(guān)系，精密度RSD=0.76%(n=6)，回收率為99.0%～100.2%。該方法簡(jiǎn)便快速，結(jié)果重現(xiàn)性好，定量準(zhǔn)確，準(zhǔn)確度、精密度高，適用于黑蕎麥中花青素的含量測(cè)定。

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(責(zé)任編輯：趙琳琳)

Extraction and content determination of anthocyanins in black buckwheat

CHEN Chang-ying，ZHU Gui-hong

(Jiangsu Xuzhou High Medical Vocational School, Xuzhou 221116,China)

We established a method of microwave extraction of anthocyanins in black buckwheat and content determination by HPLC.With 60%(v/v) ethanol as extraction solvent, solid-liquid ratio of 1∶15, temperature of 60℃, microwave extraction for 15 min,chromatographic column Shim-pack-vp-ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm),mobile phase of methanol (0.02 mol/L) -potassium dihydrogen phosphate (with phosphoric acid to adjust pH = 3.0) (80∶20),the flow rate was 1.0 ml/min,and sample quantity was 10 μl. The results showed that: in the range of 0.04-0.28 mg/ml, the regression equation had good linear relationship, precision was 0.76%, the recovery was 99.0%-100.2% .The method was simple and rapid, good reproducibility and quantitative accuracy,high accuracy and precision, as a result, suitable for determination the content of anthocyanin in black buckwheat.

microwave extraction; HPLC; black buckwheat; anthocyanins

2016-06-02;

2017-01-01

陳長(zhǎng)應(yīng)(1965-)，男，副教授，碩士，從事化學(xué)教學(xué)工作。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.01.015

S517;O657.7+2

A

1003-6202(2017)01-0064-05