孟 艷， 朱 瑩, 張亞慶, 鄒凌云, 張秋楠

(1 葫蘆島市中心醫(yī)院龍灣院區(qū) 急診科， 遼寧 葫蘆島125001；2 葫蘆島市中心醫(yī)院 消化科， 遼寧 葫蘆島125001)

半胱氨酰白三烯受體1在胰腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

孟 艷1， 朱 瑩2, 張亞慶2, 鄒凌云2, 張秋楠2

(1 葫蘆島市中心醫(yī)院龍灣院區(qū) 急診科， 遼寧 葫蘆島125001；2 葫蘆島市中心醫(yī)院 消化科， 遼寧 葫蘆島125001)

目的 探討半胱氨酰白三烯受體(CysLTR)1在胰腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床特征和預(yù)后的關(guān)系。方法 選取2015年1月-10月葫蘆島中心醫(yī)院收治的病理確診為胰腺癌的患者42例，收集癌組織及癌旁組織，采用real-time PCR檢測組織CysLTR-1 mRNA相對表達(dá)量，并對患者隨訪1年。計(jì)量資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。胰腺癌患者預(yù)后的影響因素采用多因素logistic回歸分析。結(jié)果 癌組織中CysLTR-1 mRNA相對表達(dá)量高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.037 1±0.020 5 vs 0.016 8±0.011 4，t=6.58，P<0.001)；CysLTR-1 mRNA相對表達(dá)量與患者的TNM分期(t=2.731，P=0.009)、分化程度(F=10.537，P<0.001)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(t=3.408，P=0.002)。隨訪期內(nèi)死亡17例，存活25例；死亡患者CysLTR-1 mRNA相對表達(dá)量高于存活患者(0.045 6±0.021 7 vs 0.031 3±0.019 8)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.21，P=0.03)。logistic回歸分析顯示，TNM分期[比值比(OR)=6.92，95%可信區(qū)間(95%CI)：1.30～36.82，P=0.02]、分化程度(OR=5.71，95%CI：1.44～22.62，P=0.01)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(OR=9.62，95%CI：2.23～41.46，P<0.001)是影響胰腺癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素；控制患者年齡、性別、TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤發(fā)生部位及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素后，CysLTR-1 mRNA表達(dá)量仍是影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(OR=1.11，95%CI：1.07～1.15，P=0.03)。結(jié)論 CysLTR-1參與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，可作為判斷胰腺癌預(yù)后的分子標(biāo)志物。

胰腺腫瘤； 受體， 白三烯； 腫瘤標(biāo)記， 生物學(xué)

胰腺癌發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年升高。全球疾病負(fù)擔(dān)調(diào)查顯示，從1990年到2013年，胰腺癌死亡率從18.6/10萬增加至35.2/10萬，死亡率上升47%[1]。我國胰腺癌2015年發(fā)病率為9/10萬，死亡率高達(dá)7.9/10萬[2]。由于胰腺癌發(fā)病隱匿，病情進(jìn)展迅速，5年生存率不足5%[3]。胰腺癌的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，但研究[4]證實(shí)炎癥在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotriene，CysLT)與其G蛋白偶聯(lián)受體共同參與炎癥反應(yīng)，現(xiàn)已有研究[5-6]證實(shí)半胱氨酰白三烯受體(cysteinyl lenkotriene receptor，CysLTR)1在乳腺癌及大腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，但國內(nèi)目前尚無CysLTR-1在胰腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)報(bào)道。故本研究探討胰腺癌組織中CysLTR-1 mRNA的表達(dá)及其與臨床特征和預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2015年1月-10月于葫蘆島市中心醫(yī)院行手術(shù)治療的胰腺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者術(shù)后病理證實(shí)為胰腺癌；(2)患者無其他惡性腫瘤病史；(3)術(shù)前無放療、化療等其他治療；(4)取得胰腺癌及癌旁組織標(biāo)本；(5)患者均知情同意。胰腺癌患者經(jīng)全面檢查，若無禁忌證，首選手術(shù)治療(Whipple手術(shù))。能切除者應(yīng)盡量切除腫瘤及相關(guān)淋巴結(jié)；不能切除者則行姑息性手術(shù)治療，如膽腸吻合術(shù)。所有患者術(shù)后均隨訪，隨訪截止日期為2016年8月。

1.2 主要儀器 -80 ℃超低溫冰箱、NanoDrop 2000分光光度計(jì)、紫外凝膠成像分析儀、超速冷凍臺式離心機(jī)、普通PCR擴(kuò)增儀、GeneAmp PCR System9700擴(kuò)增儀、熒光定量Roche LC480 PCR儀、電泳槽、移液器、電泳儀、離心管、電子分析天平等。

1.3 主要試劑 總RNA提取試劑盒、Real-time PCR試劑盒、PCR引物、瓊脂糖、焦炭酸二乙酯、溴化乙錠、DNA ladder marker、蒸餾水、無水乙醇、液氮、異丙醇等。

1.4 研究方法

1.4.1 總RNA提取 從-80 ℃超低溫冰箱取出20 mg癌組織及癌旁組織，按照總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，并加入少量焦炭酸二乙酯進(jìn)行溶解。

1.4.2 RNA純度及濃度測定 取上述1 μl熱變性總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳方法測定RNA完整性，對有DNA污染的RNA采用DNaseⅠ進(jìn)行相應(yīng)處理。取1 μl上述總RNA，采用分光光度計(jì)測定光密度(OD)值，即OD160/OD280，比值為1.8～2.0提示RNA無降解，同時(shí)測定RNA濃度，并進(jìn)行濃度調(diào)制。

1.4.3 逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成 所有步驟均按照real-time PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作。(1)去除基因組DNA反應(yīng)：冰上配置10 μl A反應(yīng)體系(總RNA、gDNA Eraser、Buffer和RNase Free dH2O)，置于普通PCR擴(kuò)增儀，42 ℃，2 min。(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：冰上配置10 μl B反應(yīng)體系(RT Primer MixⅠ、Buffer、PrimeScriptRT Enzyme MixⅠ和RNase Free dH2O)，混合反應(yīng)體系A(chǔ)和B，置于基因擴(kuò)增儀，37 ℃，15 min，85 ℃，5 s。(3)CysLTR-1及內(nèi)參GAPDH引物：上海Invitrogen公司完成引物的設(shè)計(jì)及合成。CysLTR-1上游引物：5′-GCACCATTGCTTTGTATCTCAACC-3′，下游引物：5′-ATACCTAACGACACATACCAACC-3′，擴(kuò)增基因145 bp。內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-GCTCCTCTATGTATGTCGTGA-3′，下游引物為5′-ACCTCCGGCCATGGTGTCTGA-3′，擴(kuò)增基因80 bp。(4)PCR擴(kuò)增：配置20 μl反應(yīng)體系(cDNA、dNTP、Buffer、上下游引物、Tag DNA聚合酶和雙氧水)。CysLTR-1 PCR反應(yīng)溫度：預(yù)熱95 ℃、變性95 ℃、退火60 ℃、延伸72 ℃和4 ℃，反應(yīng)時(shí)間分別為30 s、10 s、1 min、10 min和30 min，共循環(huán)30次。GAPDH內(nèi)參PCR反應(yīng)溫度：預(yù)熱95 ℃、變性95 ℃、退火50 ℃、延伸72 ℃和4 ℃，反應(yīng)時(shí)間分別為5 min、30 s、30 s、10 min和30 min，共循環(huán)30次。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入胰腺癌患者42例，其中男31例，女11例，年齡38～77歲，平均(61.25±13.78)歲。納入患者中26例腫瘤發(fā)生在胰頭，14例發(fā)生在胰體，2例發(fā)生在胰尾。隨訪期內(nèi)死亡17例，存活25例，且隨訪時(shí)間均滿1年。

2.2 CysLTR-1 mRNA相對表達(dá)量的比較 癌旁組織中CysLTR-1 mRNA相對表達(dá)量為0.016 8±0.011 4，癌組織中的CysLTR-1 mRNA相對表達(dá)量為0.037 1±0.020 5，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.58,P<0.001)。

2.3 CysLTR-1 mRNA相對表達(dá)量與臨床特征的關(guān)系胰腺癌組織CysLTR-1 mRNA相對表達(dá)量與TNM分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P值均<0.05)(表1)。

表1 胰腺癌組織中的CysLTR-1 mRNA相對表達(dá)量與臨床特征的關(guān)系

注：與高分化程度比較，1)P<0.05；與中分化程度比較，2)P<0.05

2.4 CysLTR-1 mRNA相對表達(dá)量與生存狀態(tài)的關(guān)系 42例患者隨訪1年內(nèi)死亡17例，病死率為40.5%。死亡患者CysLTR-1 mRNA相對表達(dá)量為0.045 6±0.021 7，高于生存患者的CysLTR-1 mRNA相對表達(dá)量(0.031 3±0.019 8)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.21,P=0.03)。

2.5 影響胰腺癌預(yù)后的多因素分析 經(jīng)logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，TNM分期、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響胰腺癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P值均<0.05);控制其他因素后，CysTLR-1 mRNA仍然是影響胰腺癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)(表2)。

表2 影響胰腺癌預(yù)后的logistic回歸分析

注：由于高分化無死亡病例，故合并高、中分化

3 討論

胰腺癌是惡性程度較高的消化道腫瘤，95%的胰腺癌為導(dǎo)管細(xì)胞腺癌。外科手術(shù)仍是目前治療胰腺癌的唯一有效方法[7-8]。東北地區(qū)胰腺癌標(biāo)化病死率顯著高于華北、華中、華南等地區(qū)。胰腺癌的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，其發(fā)生發(fā)展是遺傳因素、環(huán)境因素以及疾病因素等相互作用的結(jié)果。研究[4]發(fā)現(xiàn)炎癥如胰腺炎、膽管炎等是胰腺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素。CysLTs是一系列炎癥介質(zhì)，包括LTC4、LTE4和LTD4，由花生四烯酸和5-脂氧合酶途徑代謝產(chǎn)生，C-6位上含有半胱氨酸殘基及硫酯肽鍵是他們的共同特點(diǎn)。CysLT通過其特異的G蛋白偶聯(lián)受體(GysLTR-1、GysLTR-2)共同參與生物學(xué)作用，如炎癥反應(yīng)、血管平滑肌反應(yīng)、免疫反應(yīng)以及組織修復(fù)等。

CysLT及其受體不僅在哮喘、心血管疾病、腦損傷等方面起著重要作用，同時(shí)，研究[5-6]發(fā)現(xiàn)CysLTR(GysLTR-1)在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)。早在2002年，國外學(xué)者Hennig等[9]檢測人胰腺癌組織，發(fā)現(xiàn)CysTL的兩種受體表達(dá)量與正常胰腺組織相比，均顯著升高。王欣等[10]通過real-time PCR檢測90例乳腺癌組織，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中的CysLTR-1基因表達(dá)量顯著高于癌旁組織，且與腫瘤大小、TNM分期、組織學(xué)類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)；CysLTR-1 mRNA高表達(dá)患者的生存率顯著低于低表達(dá)患者。張世強(qiáng)等[11]采用免疫組化法檢測大腸癌組織、癌旁組織和腺瘤性息肉組織，發(fā)現(xiàn)CysLTR-1陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織和腺瘤性息肉，且與腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中CysTLR-1 mRNA相對表達(dá)量顯著高于癌旁組織，且CysTLR-1 mRNA相對表達(dá)量與TNM分期、腫瘤分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，即TNM分期越高、腫瘤分化程度越低以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的CysLTR-1 mRNA相對表達(dá)量顯著升高。同時(shí)對1年內(nèi)不同存活狀態(tài)的患者進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)死亡患者的CysLTR-1 mRNA相對表達(dá)量顯著高于存活者，提示CysTLR-1能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散，從而影響患者預(yù)后。經(jīng)多因素分析發(fā)現(xiàn)，控制患者年齡、性別、TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤發(fā)生部位及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素，CysTLR-1 mRNA仍然是影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。這與王欣等[10]和張世強(qiáng)等[11]的研究結(jié)果類似。腫瘤細(xì)胞的CysLTR分布密集，LTD4激活CysLTR-1，激活β-連環(huán)蛋白信號，從而提高TCF/LEF啟動(dòng)子活性，促進(jìn)腫瘤增殖[12]。編碼CysLTR-1基因位于X染色體的q13-21區(qū)，DNA編碼337個(gè)氨基酸，多以二聚體或多聚體形式存在。CysLTR-1通過誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分泌生長因子、介導(dǎo)炎性介質(zhì)生成，破壞細(xì)胞正常微環(huán)境，促使腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散。Ding等[13]在胰腺癌細(xì)胞系中通過合用環(huán)氧合酶2和5-脂氧合酶抑制劑，有效抑制胰腺癌細(xì)胞的CysTLR表達(dá)及血管生長因子，提示CysTLR促腫瘤增殖效應(yīng)可被相應(yīng)的受體拮抗劑所阻斷，通過損傷CysLTR-1信號通路，引起腫瘤細(xì)胞凋亡。因此筆者認(rèn)為CysLTR-1表達(dá)與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后具有重要聯(lián)系。

綜上所述，CysTLR-1 mRNA在胰腺癌組織中表達(dá)增高，且CysTLR-1表達(dá)量與患者的預(yù)后有關(guān)，可作為判斷胰腺癌預(yù)后的分子標(biāo)志物。

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(本文編輯：葛 俊)

Expression of cysteinyl leukotriene receptor-1 in pancreatic cancer tissue and its clinical significance

MENGYan,ZHUYing,ZHANGYaqing,etal.

(EmergencyDepartment,LongwanBranchofCentralHospitalofHuludao,Huludao,Liaoning125001,China)

Objective To investigate the expression of cysteinyl leukotriene receptor-1 (CysLTR-1) in pancreatic cancer tissue and its association with clinical features and prognosis. Methods A total of 42 patients with pathologically confirmed pancreatic cancer who were admitted to Central Hospital of Huludao from January to October, 2015 were enrolled, and cancer and adjacent tissues were collected. Real-time PCR was used to measure the relative mRNA expression of CysLTR-1 in these tissues, and the patients were followed up for 1 year. Thet-test was used for comparison of continuous data between groups; an analysis of variance was used for comparison between multiple groups, and the least significant differencet-test was used for comparison between any two groups. The multivariate logistic regression analysis was used to determine influential factors for the prognosis of patients with pancreatic cancer. Results The cancer tissues had significantly higher relative mRNA expression of CysLTR-1 than adjacent tissues (0.037 1±0.020 5 vs 0.016 8±0.011 4,t=6.58,P<0.001). The relative mRNA expression of CysLTR-1 was associated with TNM stage (t=2.731,P=0.009), degree of tumor differentiation (F=10.537,P<0.001), and lymph node metastasis (t=3.408,P=0.002). During the 1-year follow-up, 17 patients died and 25 survived; the patients who died had significantly higher relative mRNA expression of CysLTR-1 than those who survived (0.045 6±0.021 7 vs 0.031 3±0.019 8,t=2.21,P=0.03). The logistic regression analysis showed that TNM stage (OR=6.92, 95%CI: 1.30-36.82,P=0.02), degree of tumor differentiation (OR=5.71, 95%CI: 1.44-22.62,P=0.01), and lymph node metastasis (OR=9.62, 95%CI: 2.23-41.46,P<0.001) were prognostic factors for pancreatic cancer. After adjustment for age, sex, TNM stage, degree of tumor differentiation, tumor location, and lymph node metastasis, the mRNA expression of CysLTR-1 was still a prognostic factor for patientswith pancreatic cancer (OR=1.11, 95%CI: 1.07-1.15,P=0.03). Conclusion CysLTR-1 is involved in the development and progression of pancreatic cancer and can be used as a new molecular marker for prognostic evaluation in patients with pancreatic cancer.

pancreatic neoplasms； receptors， leukotriene； tumor markers， biological

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.01.029

2016-09-06；

2016-09-20。

孟艷(1980-)，女，主治醫(yī)師，主要從事胰腺癌、肝纖維化的診治研究。

R735.9

A

1001-5256(2017)01-0133-04