李樹靜，張志成，林佳，高超，王忠利

（錦州醫(yī)科大學附屬一院外科，遼寧錦州121001）

論著

蛋白激酶B（PKB/AKT1）小干擾RNA通過WNT/β-Catenin通路抑制人胃癌細胞株BGC-823的增殖與遷移*

李樹靜，張志成，林佳，高超，王忠利

（錦州醫(yī)科大學附屬一院外科，遼寧錦州121001）

目的觀察蛋白激酶B（PKB/AKT1）小干擾RNA（siRNA）對人胃癌細胞株BGC-823增殖與遷移的影響，探討PKB/AKT1在胃癌發(fā)生中的可能作用機制。方法體外培養(yǎng)BGC-823細胞，分為空白對照組、陰性對照組和PKB/AKT1 siRNA轉染組。實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）和Western blot法分別檢測BGC-823細胞PKB/AKT1的mRNA和蛋白表達；噻唑藍法測定細胞增殖抑制率；劃痕實驗測定細胞遷移。Western blot法檢測β-Catenin，侵襲轉移相關的上皮性鈣黏附蛋白（E-Cadherin）、神經(jīng)性鈣黏附蛋白（N-Cadherin）和基質金屬蛋白酶（MMP-9）的表達。結果與兩組對照組比較，PKB/AKT1 siRNA轉染組PKB/AKT1的mRNA和蛋白表達降低，并抑制BGC-823細胞的增殖和遷移，β-Catenin，N-Cadherin及MMP-9的蛋白表達下降，E-Cadherin表達增加。結論PKB/AKT1 siRNA抑制胃癌細胞株BGC-823的增殖和遷移，其機制可能與siRNA下調(diào)PKB/AKT1表達進而抑制WNT/β-Catenin信號通路有關。

蛋白激酶B；胃癌；BGC-823；WNT/β-Catenin

胃癌是一種常見的惡性腫瘤，嚴重威脅人類身心健康，其死亡率在所有腫瘤中位居第2位。雖然在世界范圍內(nèi)胃癌的死亡率下降明顯，但晚期胃癌療效仍然很差，其5年生存率在20％～30％，而胃癌的復發(fā)和轉移是影響其療效的主要因素[1]。因此，深入了解胃癌生物學行為的特性，解析腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機制，對指導臨床治療以及提高胃癌患者生存率及建立系統(tǒng)的胃癌診療體系有著重要的意義。越來越多的證據(jù)表明[2]，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，存在多條信號系統(tǒng)功能的紊亂，以及多種癌基因與抑癌基因表達水平的改變。為了維持胃黏膜細胞的穩(wěn)態(tài)，PI3K和WNT信號途徑等一些高度保守的信號轉導途徑對細胞的增殖、分化、遷移以及凋亡過程進行著精確的調(diào)控[3]。PI3K和WNT信號通路在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[4]，但其具體的分子生物學機制還不清楚。本研究通過在人胃癌細胞株BGC-823中特異性干擾蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT1），探討下調(diào)PKB/AKT1的表達對人胃癌細胞株BGC-823的增殖與遷移影響，分析胃癌發(fā)生發(fā)展的可能機制，為PKB/AKT1作為治療胃癌的一個潛在靶點提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

RPMI 1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司），胎牛血清（美國PAA公司），β-Catenin（C-18）和β-actin抗體（美國Santa Cruz公司），上皮性鈣黏附蛋白（E-Cadherin）、神經(jīng)性鈣黏附蛋白（N-Cadherin）及基質金屬蛋白酶（MMP-9）抗體（英國Abcam公司），辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔和兔抗山羊免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）（北京中杉金橋生物技術有限公司），噻唑藍[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]、二喹啉甲酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒和增強化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒（北京碧云天生物技術公司），AKT1 siRNA（上海吉瑪公司），Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）。BB16UV二氧化碳CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）擴增儀（美國Eppendorf公司），Sunrise自動酶標檢測儀（美國Tecan公司），凝膠自動成像儀GDS8000、水浴式電轉印槽、電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)

胃癌BGC-823細胞（購自上海細胞所）培養(yǎng)基為RPMI 1640，含10％胎牛血清、100 u/ml青霉素和100μg/ml的鏈霉素，在飽和濕度、37℃和5％CO2孵箱中培養(yǎng)，0.25％胰蛋白酶消化傳代。當細胞處于對數(shù)生長期時，以1×105/ml濃度接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中。

1.3 AKT1 siRNA的合成和轉染

針對人AKT1的cDNA序列（GenBank No.NM_ 005163）設計RNAi靶點序列。AKT1 siRNA1序列：5'-GUGCCAUGAUCUGUAUUUAUU-3'，AKT1siRNA2序列：5’-GCCAUGAUCUGUAUUUAAUUU-3'，AKT1 siRNA3序列：5'-CCUCCAAAUUCUUCAAUAAUU-3'，陰性對照序列：5'-CACUUACGCUGAGUACUUCUU-3'由上海吉瑪公司合成。BGC-823細胞接種6孔細胞培養(yǎng)板中，用Lipofectamine 2000轉染細胞。實驗分為空白對照組、陰性對照組和AKT1 siRNA轉染組。20μmol陰性對照或AKT1 siRNA轉染48 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測Akt1的mRNA表達水平

Trizol法提取各組細胞總RNA并測定RNA濃度，逆轉錄合成cDNA。PCR引物序列AKT1（5'-CAGG ATGTGGACCAACGTGA-3'，5'-TCTCCTCCTCCTCCT GCTTC-3'）；Gapdh（5'-ATGGTCAGTTTGCCCTCTCG-3'，5'-TGGACCGTGTACTTGCAGAC-3'）。PCR反應條件：50℃2 min；95℃預變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，共循環(huán)40次。擴增結束后，樣品繼續(xù)從60℃緩慢加熱到95℃，生成熔解曲線。應用2-ΔΔCT法計算AKT1 mRNA在siRNA轉染組和未轉染組的表達差異，其中甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Gapdh）為內(nèi)參對照，ΔCt＝CtAKT-CtGapdh。Ct為熒光信號強度達到預定值時所需要的擴增循環(huán)數(shù)。

1.5 MTT法測定細胞增殖率

將各實驗組細胞接種于96孔板中，每組6個復孔，培養(yǎng)48 h后，20μl MTT（5 g/L）孵育4 h。棄去培養(yǎng)液，加入150μl二甲基亞砜，振蕩15 min，使沉淀物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔光吸收值，計算48 h細胞增殖率，每組實驗重復3次。

1.6 劃痕實驗測定細胞遷移能力

將各實驗組BGC-823細胞接種6孔板中，等細胞生長至匯合度達80％，用黃槍頭劃痕，磷酸鹽緩沖溶液清洗3次，倒置顯微鏡觀察劃痕寬度并照相。

1.7 Westernblot檢測AKT1、β-Catenin、ECadherin、N-Cadherin及MMP-9的蛋白表達

提取各組細胞總蛋白并測定蛋白濃度，加入5×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）樣品緩沖液，100℃煮沸5 min，離心后上樣，10％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，含3％脫脂奶粉的三乙醇胺緩沖鹽水溶液（pH 7.4）將濾膜室溫封閉2h，濾膜再分別與AKT1、β-Catenin、E-Cadherin、N-Cadherin及MMP-9抗體及β-actin（稀釋比為1∶1 000）4℃溫育過夜。經(jīng)TBST洗滌后，HRP偶聯(lián)的IgG作為二抗（稀釋比為1∶5 000）室溫溫育2 h后洗膜，ECL發(fā)光法顯色。Image J進行蛋白條帶分析。

1.8 統(tǒng)計學方法

應用Graphpad prism 5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，多樣本均數(shù)檢驗用方差分析，P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 AKT1 siRNA轉染BGC-823細胞后效率驗證

與空白對照組和陰性對照組比較，AKT1 siRNA3轉染組抑制BGC-823細胞內(nèi)源性AKT1 mRNA水平和蛋白表達。見表1和圖1。

2.2 下調(diào)AKT1表達抑制BGC-823細胞體外增殖

與空白對照組（89±5.87）％和陰性對照組（87.0± 4.16）％比較，AKT1 siRNA轉染組（46±3.14）％能夠抑制BGC-823細胞增殖，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖2。

2.3 下調(diào)AKT1表達抑制BGC-823細胞遷移

空白對照組和陰性對照組BGC-823細胞于12 h后開始遷移，48 h后AKT1 siRNA轉染組細胞遷移的數(shù)量較對照組少，距離相對較遠（見圖3）。3組細胞48 h愈合率分別為（98.48±6.91）％、（97.21±5.82）％和（23.80±3.84）％，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.4 β-Catenin、E-Cadherin、N-Cadherin及MMP-9蛋白表達水平

與空白對照組和陰性對照組比較，AKT1 siRNA轉染組β-Catenin、N-Cadherin及MMP-9的蛋白表達下降，E-Cadherin表達增加（P＜0.01）。見表2和圖4。

表1 BGC-823細胞轉染AKT1 siRNA后AKT1蛋白表達水平（n=3，±s）

表1 BGC-823細胞轉染AKT1 siRNA后AKT1蛋白表達水平（n=3，±s）

注：?與空白對照組比較，P＜0.01

組別AKT1/β-actin空白對照組0.412±0.010陰性對照組0.403±0.013 AKT1 siRNA10.251±0.012?AKT1 siRNA20.337±0.012?AKT1 siRNA30.216±0.011?

圖1 BGC-823細胞轉染AKT1 siRNA后AKT1 mRNA和蛋白表達水平

圖2 AKT1 siRNA抑制BGC-823細胞增殖

圖3 AKT1 siRNA抑制BGC-823細胞遷移（×200）

表2 BGC-823細胞轉染AKT1 siRNA后β-Catenin、E-Cadherin、N-Cadherin及MMP-9蛋白表達水平（n=3，±s）

表2 BGC-823細胞轉染AKT1 siRNA后β-Catenin、E-Cadherin、N-Cadherin及MMP-9蛋白表達水平（n=3，±s）

注：?與空白對照組比較，P＜0.01

組別MMP-9/β-actin空白組0.521±0.0100.142±0.0130.307±0.0120.516±0.012陰性對照組0.493±0.0230.151±0.0130.321±0.0320.508±0.013 AKT siRNA30.189±0.013?0.510±0.021?0.235±0.018?0.175±0.011?β-Catenin/β-actinE-Cadherin/β-actinN-Cadherin/β-actin

圖4 BGC-823細胞轉染AKT1 siRNA后β-Catenin、E-Cadherin、N-Cadherin及MMP-9蛋白表達

3 討論

PKB/AKT是Ser/Thr蛋白激酶，PKB作為信號轉導通路的重要調(diào)節(jié)因子，主要通過PI3K/PKB途徑調(diào)節(jié)細胞代謝、細胞周期、促進細胞生長和增殖，同時還具有抗細胞凋亡作用[5]。胃癌中也存在AKT蛋白激酶的異常激活[6-7]，但AKT1活化水平改變?nèi)绾螌е挛赴┘毎飳W行為的變化，國內(nèi)外研究的還很少。本研究首先驗證AKT1 siRNA降低內(nèi)源性AKT1的mRNA水平和蛋白表達，篩選出有效的作用特異siRNA。MTT和劃痕愈合實驗表明下調(diào)AKT1表達后抑制BGC-823細胞生長和細胞遷移。研究表明，經(jīng)典的WNT/β-Catenin信號轉導途徑是調(diào)節(jié)細胞增殖和維持穩(wěn)態(tài)所必要的[8]。WNT信號通路涉及多種組成成分和調(diào)節(jié)分子的協(xié)調(diào)表達，任何組分發(fā)生異常表達都可能導致下游基因的表達變化，引起腫瘤發(fā)生[9]。PKB/AKT1是哺乳動物細胞中WNT信號通路的關鍵調(diào)節(jié)因子，為探討AKT1 siRNA抑制BGC-823細胞增殖和遷移的可能機制，筆者觀察WNT信號通路重要成員β-Catenin的表達。本研究中在BGC-823細胞下調(diào)AKT1后β-Catenin蛋白表達降低，說明AKT1可通過WNT信號影響β-Catenin的表達。腫瘤轉移的重要步驟是腫瘤細胞外基質遷移和入侵，很大程度上依賴腫瘤細胞的重塑和對細胞外基質的改變?；|金屬蛋白酶家族中的MMP-9可降解細胞外基質，破壞上皮組織的基底膜，腫瘤細胞穿過破損的基底膜發(fā)生轉移進而參與腫瘤侵襲[10]。本研究中AKT1 siRNA轉染BGC-823細胞后MMP-9的蛋白表達較對照組下調(diào)，提示AKT1可能通過調(diào)節(jié)MMP-9蛋白的表達，促進BGC-823細胞的遷移，這與CUI等[11]人的觀察結果相一致。鈣黏蛋白Cadherins超家族分子是一類鈣依賴型的細胞黏附分子，E-cadherin和N-cadherin是其代表性成員。N-cadherin蛋白過表達后可誘發(fā)腫瘤細胞移動，促進腫瘤細胞遷移和侵襲，而E-cadherin的作用正好與之相反[12]。本研究中下調(diào)AKT1表達，N-cadherin蛋白表達降低，而E-cadherin表達升高，說明AKT1可能通過調(diào)節(jié)N-cadherin和E-cadherin蛋白的表達，促進BGC-823細胞的遷移。

綜上所述，本文以WNT/β-Catenin信號轉導通路為切入點，采用RNA干涉從細胞水平探討PKB/ AKT在BGC-823胃癌細胞增殖、侵襲和遷移過程中的作用和可能的分子調(diào)控機制，為胃癌的臨床治療提供新的理論依據(jù)和實驗基礎，關于胃癌的具體發(fā)病機制還需進一步的探討。

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（張蕾 編輯）

siRNA of PKB/AKT1 inhibits proliferation and migration of BGC-823 cells via WNT/β-catenin signaling pathway*

Shu-jing Li,Zhi-cheng Zhang,Jia Lin,Chao Gao,Zhong-li Wang
(Department of General Surgery,the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou,Liaoning 121001,China)

ObjectiveTo observe the effect of double-stranded small interfering RNA(siRNA)of protein kinase B (PKB/AKT1)on gastric cancer cell line BGC-823 cell proliferation and migration,and to explore the possible underlying mechanism.MethodsBGC-823 cells were culturedin vitroand then randomly divided into blank group, negative control group and AKT1 siRNA-transfected group.AKT1 siRNA efficiency was examined through qRT-PCR and Western blot analysis.The proliferation rate of BGC-823 cells was determined through a methyl thiazolyl tetrazolium assay,and the cell migration of BGC-823 cells was examined by scratch assay.The β-catenin,ECadherin,N-Cadherin and MMP-9 protein expression levels were determined using Western blot.ResultsCompared with those of the blank and negative control groups,the expression levels of AKT1 mRNA and protein significantly decreased in the AKT1 siRNA-transfected cells.In addition,the proliferation rate and migration of BGC-823 cells were markedly decreased.The expression level of E-Cadherin increased,whereas β-catenin,N-Cadherin and MMP-9 protein levels were inhibited in the AKT1 siRNA-transfected BGC-823 cells.ConclusionssiRNA of AKT1inhibits BGC-823 cell proliferation and migration via WNT/β-catenin signaling pathway.

PKB/AKT1;gastric cancer;BGC-823 cell line;WNT/β-catenin

R581.3

：A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.02.005

1005-8982（2017）02-0031-05

2016-03-23

2014年省級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（No：201410160032）

王忠利，E-mail：wzlaily@126.com；Tel：0416-4197637