韓瑋，朱雙雙，貝媛媛，趙建，鐘玉緒，劉菲，趙玉玲，祝筱姬

（1.濟南軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)務部，山東濟南250001；2.濰坊醫(yī)學院研究生處，山東濰坊261042；3.軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京100850；4.解放軍第89醫(yī)院呼吸科，山東濰坊261021）

論著

芥子氣經腹腔和氣管致大鼠急性肺損傷纖維化指標變化*

韓瑋1，朱雙雙2，貝媛媛2，趙建3，鐘玉緒3，劉菲4，趙玉玲4，祝筱姬4

（1.濟南軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)務部，山東濟南250001；2.濰坊醫(yī)學院研究生處，山東濰坊261042；3.軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京100850；4.解放軍第89醫(yī)院呼吸科，山東濰坊261021）

目的經腹腔和氣管復制大鼠芥子氣（SM）急性肺損傷動物模型，比較2種大鼠急性肺損傷模型肺纖維化指標的差異。方法選取Sprague Dawley大鼠136只，隨機分為5組。腹腔SM組腹腔內注入稀釋的SM 0.1 ml（0.96 LD50=8 mg/kg），氣管SM組氣管內注入稀釋的SM 0.1 ml（0.98 LD50=2 mg/kg），腹腔和氣管丙二醇組分別腹腔和氣管內注入丙二醇0.1 ml，正常對照組不做任何處理。采用Masson染色和免疫組織化學，判斷肺纖維化指標變化。結果①光鏡下見72 h肺泡間隔被染成綠色的膠原纖維增多；②腹腔SM組大鼠肺泡間隔各時間段基質金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9、基質金屬蛋白酶組織抑制劑TIMP-1、TIMP-2蛋白陽性表達率分別與氣管SM組比較升高（P＜0.05）；③腹腔SM組大鼠肺泡間隔各時間段肺泡間隔Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白陽性表達率分別與氣管SM組比較升高（P＜0.05）；④腹腔SM組大鼠肺泡間隔各時間段肺泡間隔轉化生長因子（TGF-β1）、母親DPP同源物7（Smad7）蛋白陽性表達率分別與氣管SM組比較升高（P＜0.05）。結論大鼠在經腹腔和氣管SM LD50濃度相似的情況下，經腹腔途徑肺纖維化指標與經氣管比較升高，提示SM經腹腔途徑更容易誘導肺纖維化。

芥子氣；肺損傷；肺纖維化；大鼠

芥子氣（sulfur mustard，SM）是一種強有力的以細胞毒為主的雙功能烷化劑，具有誘變和癌變特性[1]。SM損傷最常見的器官是皮膚、呼吸道和眼睛，其中肺損傷所導致急性呼吸窘迫綜合征和肺纖維化是致死的重要原因[2]。SM的毒性主要歸屬于對蛋白的烷化和其親脂性，它能快速穿透靶組織，結合細胞中的脂類和核酸導致DNA損傷和細胞毒性[3]。前期筆者在復制經腹腔和氣管SM急性肺損傷動物模型的基礎上，對SM肺損傷的炎癥反應、氧化應激和細胞凋亡機制進行了研究[4-6]。本文通過對肺組織特殊染色和免疫組織化學，分析比較經腹腔和氣管SM急性肺損傷的纖維化指標變化，并探討其分子機制，為抗纖維化靶向治療提供靶標。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1，2-丙二醇溶液由天津致遠化學有限公司提供，Masson染色液由北京博奧森生物技術有限公司提供，基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、基質金屬蛋白酶組織抑制劑1（tissueinhibitorofmatrixmetalloproteinases-1，TIMP-1）、基質金屬蛋白酶組織抑制劑2（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-2，TIMP-2）、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、轉化生長因子（transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）及母親DPP同源物7（mothers against decapentaplegic homolog 7，Smad7）蛋白免疫組織化學試劑盒由北京博奧森生物技術有限公司提供。冷光源（AXEL-300型，圖特林根，德國），光學顯微鏡（BX51型，奧林巴斯公司，日本）。

1.2 實驗動物與分組

健康雄性Sprague Dawley大鼠136只（SPF級，中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，合格證號：0015902），體重280～300 g，年齡15周。

將大鼠分為腹腔SM組（32只）、腹腔丙二醇組（32只）、氣管SM組（32只）、氣管丙二醇組（32只）、正常對照組（8只）。SM液（純度＞90％）臨用前用丙二醇稀釋至所需濃度。①氣管途徑染毒動物模型復制：實驗前氣管SM組和氣管丙二醇組皮下注射阿托品（0.05 mg/kg），30 min后腹腔內注射鹽酸氯胺酮（100 mg/kg）實施麻醉，氣管內注入稀釋的SM 0.1 ml（0.98LD50=2mg/kg），氣管丙二醇組注入丙二醇0.1 ml。②腹腔途徑染毒動物模型復制：同上方法實施麻醉。腹腔SM組大鼠腹腔內注入稀釋的SM 0.1 ml（0.96 LD50=8 mg/kg），腹腔丙二醇組注入丙二醇0.1 ml。正常對照組不做任何處理。

1.3 觀察指標

收集大鼠肺組織標本共136份，用10％中性福爾馬林溶液固定標本24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，每一個標本切取15份，每5份一組進行Masson和免疫組織化學染色。

1.3.1 Masson染色石蠟切片脫蠟至水，鉻化處理，依次自來水和蒸餾水洗，用Regaud蘇木精染色液染核5～10 min，水洗和蒸餾水洗，用Masson麗春紅酸性復紅液5～10 min，以2％冰醋酸水溶液浸洗片刻，1％磷鉬酸水溶液分化3～5 min，不經水洗，直接用苯胺藍液染5 min，以0.2％冰醋酸水溶液浸洗片刻，95％酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封固。

1.3.2 免疫組織化學免疫組織化學（SP）法檢測MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ膠原蛋白、TGF-β1、Smad7蛋白的表達。石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，抗原修復，滴加兔抗大鼠MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、Ⅰ型膠原、Ⅲ膠原、TGF-β1、Smad7單克隆抗體20μl/片，再滴加二抗，DABC顯色，蘇木精襯染，常規(guī)樹脂封片。PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照。

1.3.3 顯微圖像分析采用Image-Pro Plus 6.0病理細胞圖像分析系統(tǒng)，將各組MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1、Smad7免疫組織化學染色切片行圖像分析，選取測量參數，測定陽性率和強陽性率，每間隔一個高倍視野（400倍）選取一個視野進行觀察，每張切片至少觀察5個高倍視野，計算其肺泡間隔陽性細胞比率（5個高倍視野的陽性細胞數／細胞總數×100％）并計算其平均值。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較用重復測量的多因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肺組織Masson染色結果

腹腔和氣管SM組6 h肺泡間隔可見微量被染成綠色的膠原纖維，24和48 h肺泡間隔可見少量被染成綠色的膠原纖維，72 h肺泡間隔被染成綠色的膠原纖維增多。氣管丙二醇和正常對照組肺泡間隔見微量被染成綠色的膠原纖維分布。見圖1。

2.2 大鼠MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ膠原蛋白、TGF-β1、Smad7蛋白的表達

2.2.1 MMP-2腹腔和氣管SM組6 h肺泡間隔MMP-2蛋白陽性表達呈散在分布，24和48 h肺泡間隔MMP-2蛋白陽性表達聚集成簇分布，72 h肺泡間隔MMP-2蛋白陽性表達呈密集分布；氣管丙二醇和正常對照組肺泡間隔MMP-2蛋白陽性表達呈零星分布。見圖2。5組不同時間的MMP-2蛋白陽性表達率比較，采用重復測量的方差分析，結果：①腹腔和氣管SM組不同時間點的MMP-2蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=524.282，P= 0.000）；②腹腔SM組與其他4組的MMP-2蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=2 698.015，P=0.000）；③腹腔SM組與氣管SM組的MMP-2蛋白陽性表達率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=264.515，P=0.000），呈遞增趨勢。見圖3、4。

2.2.2 MMP-9腹腔和氣管SM組6 h肺泡間隔MMP-9蛋白陽性表達呈散在分布，24和48h肺泡間隔MMP-9蛋白陽性表達聚集成簇分布，72 h肺泡間隔MMP-9蛋白陽性表達呈密集分布；氣管丙二醇和正常對照組肺泡間隔MMP-9蛋白陽性表達呈零星分布。見圖5。5組不同時間的MMP-9蛋白陽性表達率比較，采用重復測量的方差分析，結果：①腹腔和氣管SM組不同時間點的MMP-9蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=363.009，P= 0.000）；②腹腔SM組與其他4組的MMP-9蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=647.823，P= 0.000）；③腹腔SM組與氣管SM組的MMP-9蛋白陽性表達率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=161.152，P=0.000），呈遞增趨勢。見圖6、7。

2.2.3 TIMP-1腹腔和氣管SM組6 h肺泡間隔TIMP-1蛋白陽性表達呈散在分布，24和48 h肺泡間隔TIMP-1蛋白陽性表達聚集成簇分布，72 h肺泡間隔TIMP-1蛋白陽性表達呈密集分布；氣管丙二醇和正常對照組肺泡間隔TIMP-1陽性蛋白表達呈零星分布。見圖8。5組不同時間的TIMP-1蛋白陽性表達率比較，采用重復測量的方差分析，結果：①腹腔和氣管SM組不同時間點的TIMP-1陽性蛋白表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=607.751，P= 0.000）；②腹腔SM組與其他4組的TIMP-1蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=3471.017，P= 0.000）；③腹腔SM組與氣管SM組的TIMP-1蛋白陽性表達率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F= 289.162，P=0.000），呈遞增趨勢。見圖9、10。

2.2.4 TIMP-2腹腔和氣管SM組6 h肺泡間隔TIMP-2蛋白陽性表達呈散在分布，24和48 h肺泡間隔TIMP-2蛋白陽性表達聚集成簇分布，72 h肺泡間隔TIMP-2蛋白陽性表達呈密集分布；氣管丙二醇和正常對照組肺泡間隔TIMP-2蛋白陽性表達呈零星分布。見圖11。5組不同時間的TIMP-2蛋白陽性表達率比較，采用重復測量的方差分析，結果：①腹腔和氣管SM組不同時間點的TIMP-2陽性蛋白表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=341.900，P= 0.000）；②腹腔SM組與其他4組的TIMP-2蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=1540.403，P= 0.000）；③腹腔SM組與氣管SM組的TIMP-2蛋白陽性表達率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F= 166.807，P=0.000），呈遞增趨勢。見圖12、13。

2.2.5 Ⅰ型膠原腹腔和氣管SM組6 h肺泡間隔Ⅰ型膠原蛋白陽性表達呈散在分布，24和48 h肺泡間隔Ⅰ型膠原蛋白陽性表達聚集成簇分布，72 h肺泡間隔Ⅰ型膠原蛋白陽性表達呈密集分布；氣管丙二醇和正常對照組肺泡間隔Ⅰ型膠原蛋白陽性表達呈零星分布。見圖14。5組不同時間的Ⅰ型膠原蛋白陽性表達率比較，采用重復測量的方差分析，結果：①腹腔和氣管SM組不同時間點的Ⅰ型膠原蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=283.700，P=0.000）；②腹腔SM組與其他4組的Ⅰ型膠原蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=1677.605，P=0.000）；③腹腔SM組與氣管SM組的Ⅰ型膠原蛋白陽性表達率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=171.012，P=0.000），呈遞增趨勢。見圖15、16。

2.2.6 Ⅲ型膠原腹腔和氣管SM組6 h肺泡間隔Ⅲ型膠原蛋白陽性表達呈散在分布，24和48 h肺泡間隔Ⅲ型膠原蛋白陽性表達聚集成簇分布，72 h肺泡間隔Ⅲ型膠原蛋白陽性表達呈密集分布；氣管丙二醇和正常對照組肺泡間隔Ⅲ型膠原蛋白陽性表達呈零星分布。見圖17。5組不同時間的Ⅲ型膠原蛋白陽性表達率比較，采用重復測量數據的方差分析，結果：①腹腔和氣管SM組不同時間點間的Ⅲ型膠原蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F= 245.616，P=0.000）；②腹腔SM組與其他4組的Ⅲ型膠原蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=1 792.061，P=0.000）；③腹腔SM組與氣管SM組的Ⅲ型膠原蛋白陽性表達率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=136.851，P=0.000），呈遞增趨勢。見圖18、19。

2.2.7 TGF-β1腹腔和氣管SM組6 h肺泡間隔TGF-β1蛋白陽性表達呈散在分布，24和48 h肺泡間隔TGF-β1蛋白陽性表達聚集成簇分布，72 h肺泡間隔TGF-β1蛋白陽性表達呈密集分布；氣管丙二醇和正常對照組肺泡間隔TGF-β1蛋白陽性表達呈零星分布（見圖20）。5組不同時間的TGF-β1蛋白陽性表達率比較，采用重復測量數據的方差分析，結果：①腹腔和氣管SM組不同時間點的TGF-β1蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=403.720，P=0.000）。②腹腔SM組與其他4組的TGF-β1蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=2 034.116，P=0.000）。③腹腔SM組與氣管SM組的TGF-β1蛋白陽性表達率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=189.081，P=0.000），呈遞增趨勢。見圖21、22。

圖1 大鼠肺泡間隔纖維分布（Masson染色×400）

圖2 大鼠肺泡間隔MMP-2蛋白表達（×400）

圖3 大鼠肺泡間隔MMP-2蛋白陽性表達率

圖4 5組大鼠肺泡間隔MMP-2蛋白陽性表達率不同時間的變化趨勢

圖5 大鼠肺泡間隔MMP-9蛋白表達（×400）

圖6 大鼠肺泡間隔MMP-9蛋白陽性表達率

圖7 5組大鼠肺泡間隔MMP-9蛋白陽性表達率不同時間的變化趨勢

圖8 大鼠肺泡間隔TIMP-1蛋白表達（×400）

圖9 大鼠肺泡間隔TIMP-1蛋白陽性表達率

圖10 5組大鼠肺泡間隔TIMP-1蛋白陽性表達率不同時間的變化趨勢

圖11 大鼠肺泡間隔TIMP-2蛋白表達（×400）

圖12 大鼠肺泡間隔TIMP-2蛋白陽性表達率

圖13 5組大鼠肺泡間隔TIMP-2蛋白陽性表達率不同時間的變化趨勢

圖14 大鼠肺泡間隔Ⅰ型膠原蛋白表達（×400）

圖15 大鼠肺泡間隔Ⅰ型膠原蛋白陽性表達率

圖16 5組大鼠肺泡間隔Ⅰ型膠原蛋白陽性表達率不同時間的變化趨勢

圖17 大鼠肺泡間隔Ⅲ膠原蛋白表達（×400）

圖18 大鼠肺泡間隔Ⅲ型膠原蛋白陽性表達率

圖19 5組大鼠肺泡間隔Ⅲ型膠原蛋白陽性表達率不同時間的變化趨勢

圖20 大鼠肺泡間隔TGF-β1蛋白表達（×400）

圖21 大鼠肺泡間隔TGF-β1蛋白陽性表達率

圖22 5組大鼠肺泡間隔TGF-β1蛋白陽性表達率不同時間的變化趨勢

圖23 大鼠肺泡間隔Smad7蛋白表達（×400）

2.2.8 Smad7腹腔和氣管SM組6 h肺泡間隔Smad7蛋白陽性表達呈散在分布，24和48 h肺泡間隔Smad7蛋白陽性表達聚集成簇分布，72 h肺泡間隔Smad7蛋白陽性表達呈密集分布；氣管丙二醇和正常對照組肺泡間隔Smad7陽性蛋白表達呈零星分布。見圖23。5組不同時間的Smad7陽性蛋白表達率比較，采用重復測量數據的方差分析，結果：①腹腔和氣管SM組不同時間點的Smad7蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=1 165.499，P= 0.000）；②腹腔SM組與其他4組的Smad7蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=3 487.702，P=0.000）；③腹腔SM組與氣管SM組的Smad7蛋白陽性表達率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=563.158，P=0.000），呈遞增趨勢。見圖24、25。

圖24 大鼠肺泡間隔Smad7蛋白陽性表達率

圖25 5組大鼠肺泡間隔Smad7蛋白陽性表達率不同時間的變化趨勢

3 討論

肺纖維化的病理特點是肺泡持續(xù)性損傷和炎癥，細胞外基質的反復破壞、修復、重構和膠原過度沉積[7]?；|金屬蛋白酶（MMPs）能夠降解細胞外基質，其中MMP-2，MMP-9是降解構成肺泡基膜主要成分Ⅳ型膠原的主要酶類。肺纖維化早期以肺泡炎癥為主，肺組織內MMP-2和MMP-9活性增強；后期以纖維化為主，肺組織TIMP-1和TIMP-2表達則明顯增加[8]。MMP-9和TIMP-1參與肺纖維化中肺組織的重構。肺間質成纖維細胞是纖維化早期產生MMP-2的主要細胞，MMP-2過度活化可能是肺基膜Ⅳ型膠原蛋白降解的主要原因，成為啟動肺纖維化的重要機制。研究表明，Ⅳ型膠原和MMP-9與支氣管上皮細胞的移行有關[9]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)肺內Ⅰ型膠原的含量最為豐富，主要分布于支氣管樹和血管樹的周圍，Ⅲ型膠原主要見于肺泡間質內，包括肺泡壁、小葉間隔，是構成肺間質膠原的主要成分[10]。TGF-β1是目前認為的最強致纖維化因子之一，它可促進成纖維細胞的增殖和膠原蛋白的合成，是肺纖維化形成和發(fā)展的關鍵性細胞因子[11]。MMP-9可參與TGF-β1的激活，此激活過程需依賴細胞表面上的CD44[12]。另有學者發(fā)現(xiàn)，MMP-9對TGF-β1復合物的裂解作用無需CD44，可能與其他的細胞表面分子參與激活有關[13]。TIMP-1也可通過細胞因子網絡引發(fā)TGF-β1代謝紊亂，促進肺纖維化[14]。Smad蛋白通路是TGF-β1信號轉導的主要通路，Smad3、Smad4是該信號轉導通路中的主要信號蛋白，Smad7是一種抑制性的信號蛋白，在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的負性調控作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)，SM可誘導肺臟炎癥細胞浸潤，觸發(fā)MMPs/TIMPs和TGF-β/Smad的調節(jié)失衡，大量膠原蛋白肺內沉積，最終導致肺纖維化[16-18]。因此，復制SM經腹腔和氣管致急性肺損傷動物模型，探索高劑量SM致肺纖維化的分子機制，對未來的靶向干預具有潛在的意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，SM經腹腔和氣管染毒大鼠72 h后，肺泡間隔被染成綠色的膠原纖維明顯增多。腹腔組不同時間點的MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白陽性表達率與氣管SM組比較升高。腹腔SM組的MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白陽性表達率與其他4組比較升高。腹腔SM組的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TIMP-1、TIMP-2蛋白陽性表達率變化趨勢與氣管SM組比較，呈遞增趨勢。腹腔組不同時間點的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1、Smad7蛋白陽性表達率與氣管SM組比較升高。腹腔SM組的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1、Smad7蛋白陽性表達率與其他4組比較升高。腹腔SM組的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1、Smad7蛋白陽性表達率變化趨勢與氣管SM組比較，呈遞增趨勢。結果提示，在高劑量SM致急性肺損傷的早期，肺纖維化指標可發(fā)生異常變化，并隨損傷時間的延長而加重，且腹腔SM組更為明顯。正常肺組織中僅有少量的MMP-2、MMP-9表達，但在SM誘導的肺炎癥反應過程中，成纖維細胞、支氣管上皮細胞、Ⅱ型肺泡上皮細胞及一些炎癥細胞如巨噬細胞、中性粒細胞都可產生MMP-2和MMP-9，損傷肺泡基膜，啟動肺纖維化的發(fā)生。TIMP-1和TIMP-2作為MMP-2和MMP-9的生理抑制劑，與MMP-2和MMP-9以共價鍵的形式結合形成酶原復合物而特異性抑制MMP-2和MMP-9的活性[19]。本研究提示，肺泡間隔MMP-2和MMP-9的蛋白表達增加，說明肺組織損傷以炎癥反應為主。TIMP-1和TIMP-2的蛋白表達增加，可暗示為一種一過性生理補償。本結果還揭示一種可能的“遷移或移行”機制，即MMP-9可促進單核細胞轉化為肌成纖維細胞，并有利于肌成纖維細胞從血管向組織損傷處遷移。與此同時，還參與中性粒細胞跨基底膜移行[20-21]。肺血管內皮細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞是肺纖維化的主要靶細胞，間質細胞如巨噬細胞、肥大細胞參與其中，成纖維細胞和肌成纖維細胞為主要的效應細胞，TGF-β1則稱為一種分子性“開關”[22]。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-terminal kinases，JNK）信號通路能有效且特異地傳遞應答胞外的多種刺激信號。成纖維細胞中TGF-β1的激活需要Smad介導的JNK/AP等轉錄因子的活化來發(fā)揮作用，JNK則通過調控轉錄激活因子1（transcription activator-1，AP-1）來控制肺纖維化進程[23-24]。本研究顯示，肺泡間隔TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達增加，提示SM肺損傷早期會出現(xiàn)分子層面的肺纖維化指標變化。Smad7蛋白表達增加，則是觸發(fā)對TGF-β1的一種負反饋機制[25-26]。TGF-β1的過度表達是一種病態(tài)反應（損傷或炎癥），Smad7可通過對Ⅰ型受體的競爭性結合，抑制TGF-β1信號的轉導和Smad2、3的活性[27-28]。筆者認為，在SM肺損傷的炎癥反應階段，損傷和炎癥可觸發(fā)MMP-2和MMP-9蛋白的高表達，繼發(fā)TIMP-1和TIMP-2蛋白的代償性高表達；TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的高表達，繼發(fā)Smad7蛋白的代償性高表達。這些病理和生理性反應的存在，促進了分子信號通路失調的再平衡。大鼠在經腹腔和氣管SM LD50濃度相似的情況下，經腹腔途徑肺纖維化指標與經氣管比較升高，提示SM經腹腔途徑更容易誘導肺纖維化。本動物模型的復制和分子機制的探討，為SM誘導急性肺損傷的防治-抗纖維化研究提供可借鑒的靶標。

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（張蕾 編輯）

Changes of pulmonary fibrosis indexes due to sulfur mustardinduced acute lung injury in rats via intraperitoneal and tracheal injection*

Wei Han1,Shuang-shuang Zhu2,Yuan-yuan Bei2,Jian Zhao3, Yu-xu Zhong3,Fei Liu4,Yu-ling Zhao4,Xiao-ji Zhu4
(1.Department of Medical Affairs,Jinan Military General Hospital,Jinan,Shandong 250001, China;2.Department of Postgraduate,Weifang Medical College,Weifang,Shandong 261042, China;3.Institute of Pharmacology and Toxicology,Chinese Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China;4.Department of Respiratory Medicine,the 89th Hospital of Chinese PLA,Weifang,Shandong 261021,China)

ObjectiveTo establish rat model of sulfur mustard(SM)-induced acute lung injury via intraperitoneal and tracheal injection,in order to compare the differences of pulmonary fibrosis indexes.MethodsA total of 136 male Sprague Dawley rats were randomly divided into the five groups,i.e.the control group with 8 rats and other four groups(intraperitoneal SM group,intraperitoneal propylene glycol group,tracheal SM group and tracheal propylene glycol group)with 32 rats in each group.The rats in the intraperitoneal SM group were intraperitoneally injected with 0.1 ml diluted SM(0.96 LD50=8 mg/kg),the rats in the tracheal SM group were intratracheallyinjected with 0.1 ml diluted SM(0.98 LD50=2 mg/kg),the rats in the intraperitoneal propylene glycol group and the tracheal propylene glycol group were injected with 0.1 ml propylene glycol through peritoneal cavity and trachea respectively;meanwhile the status quo was kept with the normal control group.SM-induced pulmonary fibrosis indexes were observed by Masson and immunohistochemical staining.ResultsLight microscopic observation confirmed that green-stained collagen fibers increased in the alveolar septa at 72nd h.Significantly higher positive expression rates of MMP-2,MMP-9,TIMP-1 and TIMP-2 by immunohistochemical staining in the alveolar septa were detected in the intraperitoneal SM groups compared with those in the tracheal SM groups at each period of time (P＜0.05).The positive expression rates of typeⅠcollagen and typeⅢcollagen in the alveolar septa in the intraperitoneal SM groups were significantly increased compared with those in the tracheal SM group at each period of time(P＜0.05).Significantly higher positive expression rates of TGF-β1and Smad7 in the alveolar septa were also observed in the intraperitoneal SM group compared with the tracheal SM group at each period of time(P＜0.05).ConclusionsWhen LD50concentration of SM through intraperitoneal injection is similar to that through tracheal injection in rat,the indexes of pulmonary fibrosis are significantly increased after intraperitoneal injection compared with those after tracheal injection,suggesting that SM-induced pulmonary fibrosis can be more easily induced through intraperitoneal injection.

sulfur mustard;lung injury;pulmonary fibrosis;rat

R-332；R563.8

：A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.02.001

1005-8982（2017）02-0001-12

2016-05-03

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（No：2013ZX09J13103-01B）

祝筱姬，Email：xiaojizhu@163.com