陳玲玲 王洪云 楊發(fā)建 李 銘

保山中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中醫(yī)藥系,云南 保山 678000

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齒瓣石斛多糖提取工藝研究

陳玲玲 王洪云 楊發(fā)建 李 銘*

保山中醫(yī)藥高等專科學(xué)校中醫(yī)藥系,云南 保山 678000

目的：通過正交實驗對齒瓣石斛多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究。方法：采用苯酚-硫酸法考察提取容積、提取時間、提取次數(shù)、提取溫度等因素時多糖提取的影響，通過正交試驗找出最佳提取工藝。結(jié)果：多糖提取的最佳條件，提取溫度95℃、提取時間1h、提取次數(shù)2次、料液比1∶25。結(jié)論：該工藝簡單合理，多糖提取率高。

齒瓣石斛；多糖；提取工藝；正交實驗

齒瓣石斛(DerdrobiumdevoninumPaxt.)是蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium) 亞熱帶附生型多年生草本植物，俗稱黃草。在云南共有石斛品種46種，保山市龍陵縣境內(nèi)就有40余種[1]，龍陵縣是最早實現(xiàn)齒瓣石斛產(chǎn)業(yè)化栽培的地區(qū)，占全國齒瓣石斛栽培面積的70%以上[2]。現(xiàn)代研究顯示，石解具有免疫調(diào)節(jié)[3]、抗腫瘤[4]、抗炎[5]、抗氧化[6]及保肝護肝的功效，具有非常高的藥用價值，可用于多種疾病的防治。齒瓣石斛的主要有效物質(zhì)是石斛多糖，但目前對齒瓣石斛的多糖提取工藝研究較少，而水提法在石斛多糖提取的應(yīng)用非常廣泛，本文采用水提法[7]，并且通過正交試驗對齒瓣石斛多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，為開發(fā)齒瓣石斛提供技術(shù)支撐，對云南保山龍陵齒瓣石斛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有十分重要的意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV2401PC紫外可見分光光度計(日本島津)；PL-203電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；KQ-250B超聲波清洗器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；FZ102微型植物試樣粉碎機(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；101-1A電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；TDZ5-WS湘式離心機(長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘式離心機儀器有限公司)。

1.2 材料 無水葡萄糖(批號：20120417，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；苯酚(批號：20071228，天津市化學(xué)試劑三廠)；鹽酸氨基葡萄糖(批號：A308522，北京伊諾凱科技有限公司)；無水乙醇(批號：20111201，重慶川東化工集團有限公司)。齒瓣石斛(Dendrobium devonianum Paxt.) 鮮品，洗凈，60℃烘干，粉碎過60目篩，置干燥器中，備用。

2 方法

2.1 多糖的含量測定方法 按2010版《中華人民共和國藥典》[8]一部鐵皮石斛多糖含量測定方法測定齒瓣石斛多糖含量。

2.1.1 苯酚顯色溶液的配制 取苯酚100g，加鋁粉0.1g和碳酸氫鈉0.05g，常壓蒸餾，收集182℃餾分。稱取該餾分5g，置100mL容量瓶中，加新鮮蒸餾水稀釋至刻度，搖勻后，濾過至棕色試劑瓶中，得5%苯酚溶液(臨用配制)。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品12.35mg，置100mL容量瓶中加適量蒸餾水溶解，稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液(每1mL含葡萄糖0.1235mg)。2.1.3 供試品溶液的制備 取樣品粉末約0.3g，精密稱定，加水200mL，加熱回流2h，放冷，轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液4mL，置15mL離心管中，精密加入無水乙醇10mL，搖勻，冷藏1h，取出，離心(轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn))20min，棄去上清液(必要時濾過)，沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8mL，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得。測定方法：精密量取供試品溶液1.0mL，置于10mL具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下的方法，自精密加入5%苯酚溶液1mL起，依法測定吸光度，按線性回歸方程計算多糖含量。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別吸取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL至10mL具塞試管中，各以蒸餾水補至1.0mL，然后加入5%苯酚溶液1mL及5mL濃硫酸，搖勻，置沸水浴中加熱20 min，取出后在自來水中迅速冷卻至室溫，然后以蒸餾水為空白，紫外分光光度法在488nm的波長處測定吸光度，

2.3 齒瓣石斛多糖提取的單因素考察2.3.1 提取溶劑水料液比對多糖含量的影響測定 方法照供試品溶液制備項方法測定，固定其他因素，其中料液比為1∶20 ,按試驗設(shè)計設(shè)置為4個水平，即分別為加水100、150、200、250mL試驗。

2.3.2 樣品提取時間測定方法 照供試品溶液制備項方法測定，固定其他因素，其中加熱回流2h，按試驗設(shè)計設(shè)置為4個水平，即分別為加熱回流1、2、3、4h試驗。

2.3.3 提取次數(shù)測定方法 照供試品溶液制備項方法測定，固定其他因素，其中加熱回流2h，按試驗設(shè)計設(shè)置為4個水平，即分別為加熱回流1次、2次、3次、4次試驗。

2.3.4 浸提提取溫度測定方法 照供試品溶液制備項方法測定，固定其他因素，其中加熱浸提2h，按試驗設(shè)計設(shè)置為4個水平，即分別為加熱溫度70℃、80℃、90℃、95℃試驗。

2.4 正交試驗設(shè)計 為了優(yōu)化工藝，根據(jù)以上實驗結(jié)果，以提取溫度、提取時間、提取次數(shù)、料液比為實驗因素，設(shè)計L9(3)4正交試驗。正交設(shè)計見表1。

表1 提取工藝因素水平

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 紫外分光光度法在488nm的波長處測定不同濃度的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：Y= 0.0701X+0.0073，R=0.9998 (n=6)。結(jié)果見表2、圖1。

表2 葡萄糖線性結(jié)果

3.2 多糖的含量測定 結(jié)果由表3～6可知，用量水大，多糖的含量高；提取時間短多糖含量高；提取次數(shù)為2次多糖含量高；提取溫度越高多糖含量高。

表3 提取溶劑水的料液比對多糖含量測定結(jié)果的影響

表4 回流提取時間對多糖含量測定結(jié)果的影響

表5 回流提取次數(shù)對多糖含量測定結(jié)果的影響

表6 提取溫度對多糖含量測定結(jié)果的影響

3.3 正交試驗設(shè)計結(jié)果 齒瓣石斛提取正交試驗因素水平及結(jié)果見表7。按照正交結(jié)果進(jìn)行驗證試驗，齒瓣石斛多糖得率為 36.14%，RSD= 2.61%(n=3)。結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定。

表7 正交試驗結(jié)果

3.4 多糖提取工藝優(yōu)化后的驗證 按照上述優(yōu)化條件，用20.5kg 新鮮齒瓣石斛進(jìn)行放大試驗。鮮齒瓣石斛(20.5kg)，曬干，得干品3.8kg，粉碎。料液比為1 ∶25，加熱回流2次，每次回流1h，放冷，減壓濃縮至50L，加入4倍量無水乙醇，冷藏沉淀粗多糖，冷凍干燥得粗多糖1014.6g，即多糖含量為26.7%。

4 討論

根據(jù)多糖性能，選用水煎煮工藝法，依據(jù)2010版藥典中供試品溶液制備方法，可發(fā)現(xiàn)多糖提取過程中有4個因素對多糖含量的影響較大，故而本次齒瓣石斛多糖提取工藝優(yōu)化試驗設(shè)計了4個因素4個水平的優(yōu)化試驗。從單因素試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著提取溶劑料液比的增大而增加，多糖提取率呈現(xiàn)出遞增的現(xiàn)象，在料液比1∶25的時候多糖含量最高；提取時間的長短對多糖提取率的影響則呈現(xiàn)遞減的現(xiàn)象，在2h以后，多糖含量呈遞減的現(xiàn)象；隨著提取次數(shù)的增加，多糖的含量增加，但提取次數(shù)大于2次以后，多糖的含量增加不明顯，可能原材料中的多糖接近全部溶出，說明提取次數(shù)對于多糖的含量有影響；在不同溫度下提取多糖，70℃、80℃、90℃、95℃的條件下提取多糖，結(jié)果分別為28.3%、28.7%、29.5%、32.3%，隨著溫度的升高多糖的含量有所升高在100℃達(dá)到最高狀態(tài)。

由正交試驗極差分析可知，提取溫度、提取次數(shù)、提取料液比及提取時間均對提取多糖的含量有顯著的影響，其因素主次順序為 A> C> D > B，即最重要的因素為提取溫度，其次是提取次數(shù)，再次是提取料液比，最后是提取時間。最佳組合為A3B1C2D3，可以確定齒瓣石斛多糖提取在料液比1∶25，加熱回流1h，提取次數(shù)2次，提取溫度100℃條件下最優(yōu)。該工藝穩(wěn)定可行，可用于齒瓣石斛多糖的提取。齒瓣石斛為保山龍陵的珍貴藥物資源，對齒瓣石斛多糖提取工藝的優(yōu)化研究，有利于提高其利用率，為開發(fā)齒瓣石斛提供技術(shù)支撐。

[1] 云南藥材公司. 云南中藥資源名錄[M]. 北京: 科學(xué)出版社，1993: 669.

[2] 明興加，劉家保，鐘國躍，等. 珍稀齒瓣石斛的生物學(xué)特性及其野生資源保護[J]. 中國野生植物資源，2012，11(25) : 511-513.

[3]宋寧，陸瑛，邱明華．球花石斛多糖免疫調(diào)節(jié)作用的研究[J]．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18(3)：445.

[4]張紅玉，戴關(guān)海，馬翠，等．鐵皮石斛多糖對S180肉瘤小鼠免疫功能的影響[J]．浙江中醫(yī)雜志，2009，44(5)：380.

[5]查學(xué)強，王軍輝，潘麗華，等．石斛多糖體外抗氧化活性的研究[J].食品科學(xué)，2007，28(10)：90．

[6]李小瓊，金徽，葛曉軍，等．金釵石斛多糖對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的影響[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(28)：13634.

[7]錢葉，呂不望.石斛中石斛多糖的提取工藝研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2005，22(4)：293-294.

[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010：附錄IVA23-24.

(編輯：穆麗華)

Research on the Crafts of Extracting Polysaccharide from Dendrobium

CHEN Lingling WANG Hongyun YANG Fajiang LI Ming*

Baoshan College of Traditionnal Chinese Medicine Department of TCM,Baoshan 678000,China

Objective The author carried out optimization study of the crafts of extracting polysaccharide from dendrobium devonianum through orthogonal tests. Methods The author used phenol - sulfuric acid method to study the extraction volume, extraction period, extraction times, extraction temperature and other factors affect the polysaccharide extracted, and find the best extraction process by orthogonal test. Results The optimum conditions of polysaccharide extraction is that:temperature of 95℃, extraction time 1h, extraction times 2 times, solid-liquid ratio 1∶25. Conclusion The process is simple，reasonable，with high rates of extraction of polysaccharide．

Dendrobium Devonianum; Polysaccharide; Extraction Process; Orthogonal Experiment

2016-10-19

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃自籌項目(2013FZ095)。

陳玲玲(1974-)，女，碩士，主要從事中藥制劑研究。E-mail：545994167@qq.com

李銘(1967-)，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)學(xué)。E-mail:xlynkm@126.com

R917

A

1007-8517(2017)01-0026-03