閔紅巍，劉克敏，曲鐵兵，亓攀，顧蕊

凍結(jié)肩患者肩關(guān)節(jié)致纖維化細胞因子和炎癥細胞因子的表達①

閔紅巍，劉克敏，曲鐵兵，亓攀，顧蕊

目的探討致纖維化細胞因子和炎癥細胞因子在凍結(jié)肩發(fā)生中的可能作用。方法2014年9月至2016年4月，20例凍結(jié)肩患者接受肩關(guān)節(jié)鏡手術(shù)，其中原發(fā)性凍結(jié)肩10例(A組)，繼發(fā)性凍結(jié)肩10例(B組)。以同期接受肩關(guān)節(jié)鏡手術(shù)的10例非凍結(jié)肩患者作為對照(C組)。qPCR檢測肩關(guān)節(jié)滑膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP1)、MMP3、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1 (IL-1)、IL-6、IL-8、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)mRNA表達水平。結(jié)果A組和B組MMP1和MMP3 mRNA表達高于C組(P＜0.05)，TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、GM-CSF和M-CSF mRNA顯著高于C組(P＜0.001)，A組和B組間各因子mRNA表達無顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)論凍結(jié)肩的發(fā)生可能與患者關(guān)節(jié)滑膜組織中致纖維化細胞因子和炎癥細胞因子的高表達有關(guān)。

凍結(jié)肩；滑膜；纖維化；炎癥；細胞因子

[本文著錄格式] 閔紅巍，劉克敏，曲鐵兵，等.凍結(jié)肩患者肩關(guān)節(jié)致纖維化細胞因子和炎癥細胞因子的表達[J].中國康復(fù)理論與實踐,2017,23(1):97-100.

CITED AS:Min HW,Liu KM,Qu TB,et al.Expression of fibrogenic cytokine and inflammatory cytokine in frozen shoulder[J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(1):97-100.

100多年前就有人描述凍結(jié)肩(frozen shoulder)，至今凍結(jié)肩的發(fā)病機制仍未完全明了。目前認為，由于肩關(guān)節(jié)囊及其周圍韌帶的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肩關(guān)節(jié)疼痛，活動受限[1]，研究的熱點集中于凍結(jié)肩的免疫學(xué)基礎(chǔ)和炎癥介質(zhì)等方面。最近的研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性凍結(jié)肩患者肩關(guān)節(jié)滑膜組織中，致纖維化細胞因子和炎癥細胞因子mRNA表達明顯異常，這可能是凍結(jié)肩發(fā)病原因之一。本研究旨通過qPCR技術(shù)，定量分析凍結(jié)肩患者肩關(guān)節(jié)滑膜組織中致纖維化細胞因子基質(zhì)金屬蛋 白 酶 1(matrix metalloproteinase 1,MMP1)、MMP3，和炎癥細胞因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin-1,IL-1)、IL-6、IL-8、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)的mRNA表達水平，探討凍結(jié)肩的發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2014年9月至2016年4月，中國康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院骨科20例凍結(jié)肩患者接受關(guān)節(jié)鏡治療，其中原發(fā)性凍結(jié)肩10例為A組，繼發(fā)性凍結(jié)肩10例為B組。B組中，6例繼發(fā)于肱骨近端骨折，3例繼發(fā)于鎖骨骨折，1例繼發(fā)于肩鎖關(guān)節(jié)脫位。選擇無凍結(jié)肩癥狀而需要行肩關(guān)節(jié)鏡手術(shù)患者10例作為對照組(C組)，其中肩關(guān)節(jié)不穩(wěn)4例，肩袖損傷3例，肩峰下撞擊癥3例。三組患者的性別、年齡、患病側(cè)別及病程無顯著性差異。見表1。

表1 各組一般資料比較

A組和B組均經(jīng)至少3個月系統(tǒng)保守治療，效果不佳。三組患者在肩關(guān)節(jié)鏡手術(shù)中，從不同部位取2塊滑膜標(biāo)本，大小約1×1 cm。取得樣本前均獲得患者知情同意。

本研究獲得中國康復(fù)研究中心倫理委員會批準(zhǔn)，批號：2015k062。

凍結(jié)肩診斷標(biāo)準(zhǔn)：①關(guān)節(jié)僵硬癥狀持續(xù)3個月以上；②關(guān)節(jié)活動度喪失50%以上[2]。原發(fā)性凍結(jié)肩是指無明顯誘因的凍結(jié)肩，繼發(fā)性凍結(jié)肩是指可以回憶起疾病的誘因，如外傷、關(guān)節(jié)過度使用或其他關(guān)節(jié)病。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲；②病程＞3個月。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)感染、傷口未愈；②并發(fā)擠壓綜合征；③并發(fā)嚴重心、肝、腎功能不全；④并發(fā)腦或脊髓損傷，遺有神經(jīng)癥狀；⑤不能配合治療；⑥嚴重骨質(zhì)疏松癥；⑦患肢存在周圍神經(jīng)損傷；⑧病理性骨折。

1.2 方法

滑膜組織液氮研磨成粉狀，按說明書(康維世紀，CW0581)提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(Thermo Sciectific公司，K1621)，以cDNA為模板，引物擴增各個基因(表2)，同時擴增內(nèi)參β-actin(上游TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG；下游TGA CGT GGA CAT CCG CAAAG)，按照Maxima SYBR Green qPCR Master Mix說明書(Thermo Sciectific公司，k0252)混合反應(yīng)體系，將PCR板置于7900HT熒光定量PCR儀(ABI公司)中進行PCR擴增反應(yīng)。擴增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃30 s，56℃30 s，72℃2 min，40個循環(huán)；溶解曲線設(shè)置為：變性95℃15 s，退火延伸60℃1 min，95℃15 s。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法處理數(shù)據(jù)。

表2 各目的基因qPCR所需的引物探針序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，計量資料采用(±s)表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett檢驗。計數(shù)資料用χ2檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

A組和B組肩關(guān)節(jié)滑膜組織中MMP1、MMP3、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、GM-CSF和M-CSF mRNA表達均高于C組(P＜0.05)，A組和B組間無顯著性差異(P＞0.05)。見表3。

表3 各組細胞因子mRNA表達

3 討論

Duplay[3]首先于1872年將一種肩關(guān)節(jié)疼痛伴活動受限的自限性疾病命名為“肩周炎”。1934年Codman[4]將這種疾病重新命名為“凍結(jié)肩”，認為該疾病最顯著的特征是肩關(guān)節(jié)前屈和外旋活動度下降。1945年，Neviaser[5]將這種疾病命名為“粘連性關(guān)節(jié)囊炎”。目前大多數(shù)學(xué)者認為，凍結(jié)肩的病理學(xué)變化主要表現(xiàn)為肩關(guān)節(jié)囊攣縮、增厚，尤其在肩袖間隙的喙肱韌帶病變是引起關(guān)節(jié)囊攣縮、增厚病理學(xué)改變的基礎(chǔ)，但究竟是炎癥反應(yīng)過程抑或纖維化過程仍存在爭議。大家普遍認為，關(guān)節(jié)囊的炎癥和纖維化是凍結(jié)肩疼痛和活動障礙的主要原因[6-7]。

盡管國內(nèi)外學(xué)者進行了大量研究，凍結(jié)肩的病因和發(fā)病機制還不十分清楚，有關(guān)其最佳的治療方案也沒有一致意見[8]。有研究[9]發(fā)現(xiàn)，凍結(jié)肩和反射性交感神經(jīng)營養(yǎng)不良類疾病，如Sudeck綜合征，在臨床表現(xiàn)上有很多相似之處。放射性同位素骨掃描提示，肩周炎和Sudeck綜合征的病變區(qū)域都有同位素攝取增加，患側(cè)肱骨頭進展性骨量減少。因而有學(xué)者[10]提出，原發(fā)性凍結(jié)肩很可能是一種反射性交感神經(jīng)營養(yǎng)不良疾病，并據(jù)此予降鈣素以增加骨量的治療，獲得較滿意的療效。Smith等[11]發(fā)現(xiàn)，58例原發(fā)性凍結(jié)肩患者中，30例(52%)并發(fā)Dupuytren攣縮，是普通人群中Dupuytren攣縮患病率的8.7倍。Bunker等[12]通過免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性凍結(jié)肩中有明顯的成纖維細胞增生，無炎癥和滑膜受累，病理表現(xiàn)與手掌腱膜Dupuytren攣縮很相似；因而提出原發(fā)性凍結(jié)肩是一種“Dupuytren攣縮樣疾病”。

我們的研究顯示，原發(fā)性凍結(jié)肩和繼發(fā)性凍結(jié)肩患者MMP1、MMP3的表達增高。Kabbabe等[6]通過前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性凍結(jié)肩滑膜組織中MMP1、MMP3高于對照組，與我們的研究結(jié)果一致。對這些致纖維化細胞因子作用的進一步了解，在細胞增殖功能減弱的情況下(如肩袖疾病)，可將其用于增強組織的修復(fù)[13-14]。

凍結(jié)肩發(fā)病機制至今尚未完全闡明，但炎癥機制在其發(fā)病過程中所扮演的重要角色得到醫(yī)學(xué)界較為廣泛認可。我們的研究顯示，凍結(jié)肩患者炎癥細胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、GM-CSF和M-CSF mRNA表達升高，說明炎癥反應(yīng)在凍結(jié)肩的發(fā)生中可能起到一定的作用。IL-1、IL-6和TNF-a是常見的炎癥因子，在免疫介導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)中起重要作用[15-16]。已經(jīng)報道IL-1和TNF-α能通過環(huán)氧化酶的表達而產(chǎn)生前列腺素，進而引起疼痛[17]。此外，炎性因子如TNF-α、IL-1，IL-6等可促進各類細胞外基質(zhì)增殖，在傷口愈合過程中起重要作用[18]。Mullett等[7]報道關(guān)節(jié)液在凍結(jié)肩發(fā)病機制中的作用，顯示關(guān)節(jié)液中富含影響纖維化的炎癥因子。Lho等[19]研究顯示，原發(fā)性凍結(jié)肩患者肩峰下滑囊組織中TNF-α、IL-1等炎癥因子的表達顯著高于對照組。體外研究發(fā)現(xiàn)[20]，中性粒細胞、單核/巨噬細胞在GM-CSF作用下，分泌IL-1、IL6、TNF-α等炎癥因子的水平明顯升高，并且吞噬能力也明顯增強。TNF-α主要由單核巨噬細胞產(chǎn)生，具有廣泛致炎和免疫調(diào)節(jié)作用。也有研究顯示，M-CSF單獨作用就能誘導(dǎo)單核細胞產(chǎn)生低水平的TNF-α[21]。

本研究存在著一定局限性。一方面病例數(shù)量相對較少。今后將進一步擴大樣本數(shù)量，使結(jié)論更加準(zhǔn)確；另一方面，患者均來自同一家醫(yī)院，由于康復(fù)醫(yī)院的固有特點，本研究中繼發(fā)性凍結(jié)肩患者的疾病嚴重程度均較一般醫(yī)院重。此外，未對肩關(guān)節(jié)滑膜組織的生長因子進行檢測，而生長因子在凍結(jié)肩的發(fā)病中也起一定作用。

凍結(jié)肩的發(fā)病過程比較復(fù)雜，對其發(fā)病機制的了解也比較有限。本研究顯示，凍結(jié)肩患者肩關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織中致纖維化細胞因子和炎癥因子表達水平升高，說明凍結(jié)肩的發(fā)生是由于機體對未知的損傷刺激產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，繼而發(fā)生纖維化的過程。推測非甾體類抗炎藥物和關(guān)節(jié)內(nèi)注射激素可能會改變凍結(jié)肩的發(fā)病進程，對治療凍結(jié)肩有一定的作用。希望隨著對凍結(jié)肩發(fā)病機制理解的進一步深入，能夠不斷提高凍結(jié)肩治療的水平。

[1]Sherian MA,Hannafin JA.Upper extremity.Emphasis of frozen shoulder[J].Orthop Clin NorthAm,2006,37(4):531-539.

[2]Tauro JC,Paulson M.Shoulder stiffness[J].Arthroscopy, 2008,24(8):949-955.

[3]Duplay ES.De la Periarthrite scapulohumerale[J].Arch Gen Med,1872,20:513-542.

[4]Codman EA.Tendinitis of short rotators[M]//Codman EA. The Shoulder:Rupture of the Supraspinatus Tendon and Other Lesions in or about the Subacromial Bursa.Boston:Thomas Todd,1934.

[5]Neviaser JS.Adhesive capsulitis of the shoulder-A study of the pathological findings in periarthritis of the shoulder[J].J Bone Joint Surg,1945,27(2):211-222.

[6]Kabbabe B,Ramkumar S,Richardson M.Cytogenetic analysis of the pathology of frozen shoulder[J].Int J Shoulder Surg, 2010,4(3):75-78.

[7]Mullett H,Byrne D,Colville J.Adhesive capsulitis:human fibroblast response to shoulder joint aspirate from patients with stage II disease[J].J Shoulder Elbow Surg,2007,16(3): 290-294.

[8]Rangan A,Goodchild L,Gibson J,et al.Frozen shoulder[J]. Shoulder Elbow,2015,7(4):299-307.

[9]Okamura K,Ozaki J.Bone mineral density of the shoulder joint in frozen shoulder[J].Arch Orthop Trauma Surg,1999, 119(7-8):363-367.

[10]Müller LP,Müller LA,Happ J,et al.Frozen shoulder:a sympathetic dystrophy?[J].Arch Orthop Trauma Surg,2000,120 (1-2):84-87.

[11]Smith SP,Devaraj VS,Bunker TD.The association between frozen shoulder and Dupuytren's disease[J].J Shoulder Elbow Surg,2001,10(2):149-151.

[12]Bunker TD,Anthony PP.The pathology of frozen shoulder.A Dupuytren-like disease[J].J Bone Joint Surg Br,1995,77(5): 677-683.

[13]Nho SJ,Delos D,Yadav H,et al.Biomechanical and biologic augmentation for the treatmentof massive rotator cuff tears[J]. Am J Sports Med,2010,38(3):619-629.

[14]Longo UG,Rizzello G,Berton A,et al.Biological strategies to enhance rotator cuff healing[J].Curr Stem Cell Res Ther, 2013,8(6):464-470.

[15]Blaine TA,Kim YS,Voloshin I,et al.The molecular pathophysiology of subacromial bursitis in rotator cuff disease[J].J Shoulder Elbow Surg,2005,14(1 Suppl):84S-89S.

[16]Voloshin I,Gelinas J,Maloney MD,et al.Proinflammatory cytokines and metalloproteases are expressed in the subacromial bursa in patients with rotator cuff disease[J].Arthroscopy, 2005,21(9):1076.e1-1076.e9.

[17]Crofford LJ.COX-1 and COX-2 tissue expression:implications and predictions[J].J Rheumatol Suppl,1997,49(7): 15-19.

[18]Zimowska M,Kasprzycka P,Bocian K,et al.Inflammatory response during slow-and fast-twitch muscle regeneration[J]. Muscle Nerve,2016-07-11.[Epub ahead of print]

[19]Lho YM,Ha E,Cho CH,et al.Inflammatory cytokines are overexpressed in the subacromial bursa of frozen shoulder[J]. J Shoulder Elbow Surg,2013,22(5):666-672.

[20]Fossati G,Mazzucchelli I,Gritti D,et al.In vitro effects of GM-CSF on mature peripheral blood neutrophils[J].Int J Mol Med,1998,1(6):943-951.

[21]Ji XH,Sun LH,Qin JC,et al.Effects of rhM-CSF expressed in silkworm on cytokine productions and membrane molecule expressions of human monocytes[J].Acta Pharmacol Sin, 2000,21(9):797-801.

Expression of Fibrogenic Cytokine and Inflammatory Cytokine in Frozen Shoulder

MIN Hong-wei,LIU Ke-min,QU Tie-bing,QI Pan,GU Rui
1.Capital Medical University School of Rehabilitation Medicine,Beijing 100068,China;2.Department of Orthopedics and Rehabilitation,Beijing Bo'ai Hospital,China Rehabilitation Research Center,Beijing 100068,China

LIU Ke-min.E-mail:keminlqliu@sina.com

ObjectiveTo explore the role of fibrogenic cytokines and inflammatory cytokines in the pathogenesis of frozen shoulder.MethodsFrom September,2014 to April,2016,20 patients with frozen shoulder accepted arthroscopic surgery were included,ten of them were diagnosed as primary frozen shoulder(group A),the other ten were secondary frozen shoulder(group B).Other ten patients undergoing shoulder arthroscopy for instability(4 cases),rotator cuff injury(3 cases)and subacromial impingement(3 cases)were as the controls (group C).The mRNA levels of matrix metalloproteinase(MMP)1,MMP3,tumour necrosis factor-α(TNF-α),interleukin(IL)-1,IL-6, IL-8,granulocyte-macrophage colony stimulating factor(GM-CSF)and M-CSF in synovium were analyzed with quantitative polymerase chain reaction.ResultsThe expression of mRNA of MMP1,MMP3,TNF-α,IL-1,IL-6,IL-8,GM-CSF and M-CSF were more in group A and group B than in group C(P＜0.05).There was no significant difference between group A and group B(P＞0.05).ConclusionThe fibrogenic cytokines and inflammatory cytokines may play a role in the pathogenesis of frozen shoulder.

frozen shoulder;synovium;fibration;inflammation;cytokine

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.01.023

R684

A

1006-9771(2017)01-0097-04

2016-09-22

2016-11-09)

1.北京豐臺區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)科學(xué)研究項目(No.2014-豐臺)；2.中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目(No.2015CZ-13)。

1.首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京市100068；2.中國康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院骨科，北京市100068。作者簡介：閔紅巍(1971-)，男，漢族，黑龍江哈爾濱市人，博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向：骨關(guān)節(jié)康復(fù)。通訊作者：劉克敏。E-mail:keminlqliu@sina.com。