韓麗紅 ，閆斌 ，高麗君 ，蘇燕 ，楊文杰 ，秦文斌

1.包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，內(nèi)蒙古包頭 014060；2.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外二科，內(nèi)蒙古包頭 014010

肝臟對(duì)人體的重要性眾所周知。關(guān)于肝病時(shí)紅細(xì)胞(red blood cell,RBC)和血紅蛋白（hemoglobin ，Hb）變化的研究表明，肝臟病變會(huì)造成紅細(xì)胞系統(tǒng)異常，出現(xiàn)不同程度的貧血現(xiàn)象。肝臟是造血的主要器官，以生成紅細(xì)胞為主，那么肝切除時(shí)紅細(xì)胞會(huì)怎樣，籠統(tǒng)來說，肯定有變化，但查不到這方面的文獻(xiàn)報(bào)道。包頭醫(yī)學(xué)院血紅蛋白研究室長期從事紅細(xì)胞電泳釋放血紅蛋白的研究[1-6]，該文中利用這種技術(shù)研究了小鼠肝切除后紅細(xì)胞釋放血紅蛋白的情況，取2016年12月—2017年4月于包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室行小鼠肝切除術(shù)后0～7、14 d的血紅細(xì)胞做血紅蛋白釋放電泳，與未做手術(shù)小鼠及假手術(shù)組的小鼠的血紅蛋白釋放試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比，每組3～5只小鼠，觀察其多帶釋放情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的來源

C57小鼠，SPF級(jí)，雄性，體重20～25 g。由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物部提供。小鼠稱重后4%水合氯醛(0.01 mL/g)腹腔注射麻醉小鼠，仰臥固定其四肢于手術(shù)板上。常規(guī)切口處剃毛備皮。碘伏消毒，無菌紗布覆蓋，取劍突至恥骨上方腹部正中切口逐層入腹。按Higgins等經(jīng)典方法，于腹部正中做切口，擠出肝臟左葉和中葉于肝蒂部結(jié)扎后切除，關(guān)閉腹腔，按層縫合切口。肝部分切除手術(shù)均在上午進(jìn)行，嚴(yán)格按照無菌手術(shù)操作，術(shù)后保溫并自由進(jìn)食及飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

用小鼠的全血或分離得到的紅細(xì)胞做淀粉-瓊脂糖凝膠電泳。先普泳，電勢梯度6 V/cm，泳2 h，停電15 min。前進(jìn)再釋放即電勢梯度6 V/cm，再通電30 min。后退再釋放即電勢梯度 6 V/cm，倒正負(fù)極再通電15 min。電泳后先染麗春紅染液過夜，取出、照相、晾干。再染聯(lián)苯胺染液，加3%過氧化氫直到血紅蛋白變成藍(lán)黑顏色，轉(zhuǎn)入漂洗液漂洗兩次，5 min/次，取出晾干。

2 結(jié)果

2.1 第一批肝切除后小鼠紅細(xì)胞的單向多帶再釋放電泳結(jié)果

由圖1可以看出這一批標(biāo)本中假手術(shù)標(biāo)本再釋放明顯弱于肝切除1 d者，肝切除14 d標(biāo)本出現(xiàn)梯帶增強(qiáng)。

圖1 第一批肝切除后小鼠紅細(xì)胞的單向多帶再釋放電泳結(jié)果

2.2 第二批肝切除后小鼠紅細(xì)胞的單向多帶再釋放電泳結(jié)果

由圖2可以看出，這一批標(biāo)本中，與未切除標(biāo)本比較，肝切除1、3、4 d標(biāo)本都顯示出梯帶增強(qiáng)。

圖2 第二批肝切除后小鼠紅細(xì)胞的單向多帶再釋放電泳結(jié)果

2.3 肝切除后6 h與14 d小鼠紅細(xì)胞的雙向多帶再釋放電泳結(jié)果

由圖3可以看出，肝切除后電泳釋放出來的多帶是與主要帶（箭頭↑所指處）相平行，說明它們是來自再釋放[7-9]。另外，14 d小鼠紅細(xì)胞的多帶再釋放明顯大于6 h者，支持單向電泳時(shí)的結(jié)果。

圖3 肝切除后6 h與14天小鼠紅細(xì)胞的雙向多帶再釋放電泳結(jié)果

2.4 小鼠肝切除后標(biāo)本的綜合結(jié)果

由此可以看出全部小鼠肝切除實(shí)驗(yàn)結(jié)果，它來自五批標(biāo)本，綜合起來包括了肝切除實(shí)驗(yàn)的全部過程0～7 d。從綜合結(jié)果來看，未做手術(shù)和做過假手術(shù)的標(biāo)本再釋放強(qiáng)度較低，其他肝切除后不同時(shí)間標(biāo)本的再釋放強(qiáng)度幾乎都明顯提高，個(gè)別結(jié)果偏低可能與標(biāo)本量太少有關(guān)。

圖4 小鼠肝切除后標(biāo)本的綜合結(jié)果

3 討論

紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白釋放試驗(yàn) （hemoglobin releasing test，HRT）是將紅細(xì)胞加在淀粉-瓊脂糖混合凝膠中進(jìn)行電泳，一次通電完成電泳，此時(shí)有 Hb釋放出來，稱為“初釋放”；在電泳釋放過程中進(jìn)行“斷電-再通電”，又會(huì)有Hb從原點(diǎn)釋放出來，稱為“再釋放”。正常情況下，初釋放時(shí)，紅細(xì)胞內(nèi)的大部分 Hb都釋放出來，殘留較少；再釋放時(shí)，殘留Hb再次離開紅細(xì)胞，出現(xiàn)新的Hb區(qū)帶。關(guān)于人類疾病與血紅蛋白釋放關(guān)系進(jìn)行了一系列研究[8-10]。HRT是該研究室提出的一種實(shí)驗(yàn)方法,用來觀察各種條件下紅細(xì)胞釋放血紅蛋白的情況。釋放的動(dòng)力是電泳,這是共同因素,不同釋放結(jié)果則取決于紅細(xì)胞以及其與血漿環(huán)境之間的相互作用。

該研究室研究過人類肝硬化時(shí)血紅蛋白釋放的變化，發(fā)現(xiàn)肝硬化患者的血紅蛋白的再釋放增強(qiáng)[9]。共篩查了38例全血標(biāo)本的HRT，利用等低滲全程試驗(yàn)和雙層對(duì)角線電泳技術(shù)，比較了肝硬化患者和肝功正常血液標(biāo)本的 HRT，發(fā)現(xiàn)肝硬化患者標(biāo)本的“前進(jìn)”和“后退”再釋放都增強(qiáng)。選取電泳效果最明顯的等低滲標(biāo)本做對(duì)角線電泳，可以看到 Hb后退成分，說明了肝硬化患者紅細(xì)胞中 Hb的存在狀態(tài)異常，前進(jìn)再釋放釋放很多Hb后，后退再釋放又釋放出較多Hb。因此，得出結(jié)論肝功異常會(huì)影響到紅細(xì)胞膜上成分，這一點(diǎn)早有研究，但肝再生時(shí)紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白的電泳釋放情況尚無人研究，該文從血紅蛋白電泳釋放角度研討紅細(xì)胞內(nèi)的變化。

肝臟有很強(qiáng)的再生能力，小鼠肝部分切除術(shù)后大約兩周肝臟既可以完成再生。研究發(fā)現(xiàn)，肝部分切除后肝再生的過程中，小鼠紅細(xì)胞血紅蛋白釋放試驗(yàn)發(fā)生了改變，未做手術(shù)和做過假手術(shù)的標(biāo)本再釋放強(qiáng)度較低，其它肝切除后不同時(shí)間標(biāo)本的再釋放強(qiáng)度幾乎都明顯提高，個(gè)別結(jié)果偏低可能與標(biāo)本量太少有關(guān)。肝臟再生的過程中，肝功能受到一定影響，紅細(xì)胞的血紅蛋白也發(fā)生了改變。血紅蛋白釋放實(shí)驗(yàn)增強(qiáng)，今后的研究可以從血清化驗(yàn)指標(biāo)入手，進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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[1]韓麗紅,楊文杰,高麗君,等.血紅蛋白F與血紅蛋白A2之間的交叉互作[J].中國醫(yī)藥指南,2015,13(5):62-63.

[2]韓麗紅,閆斌,高麗君,等.腫瘤患者紅細(xì)胞的血紅蛋白釋放實(shí)驗(yàn)初步研究[J].中國醫(yī)藥指南,2015,13(8):12-13.

[3]喬姝,高麗君,寶勿仁必力格,等.ABO血型的雙向全程釋放電泳圖譜[J].包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2016,32(7):5-7.

[4]Caili Wang,Liping Liu,Lihong Han,et al.The effect of plasma components on hemoglobin release test in red blood cells (RBC)[J].Toxicological&Environmental Chemistry,2017,99(3):448-459.

[5]Yan Su,Lisha Han a,Lijun Gao,et al.Abnormal increased re-released Hb from RBCs of an intrahepatic bile duct car cinoma patient was detected by electrophoresis release test[J].Bio-Medical Materials and Engineering,2015,26:S2049-S2054.

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[9]寶勿仁必力格,王翠峰.肝硬化患者血紅蛋白釋放試驗(yàn)明顯異常[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2011,10（24）：1915-1917.

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