何永峰, 錢建瑛, 李 恒, 陸震鳴, 許正宏, 史勁松

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GC-MS聯(lián)合二維核磁對文蛤多糖Fr.2A組分結(jié)構(gòu)的解析

何永峰, 錢建瑛, 李 恒, 陸震鳴, 許正宏, 史勁松

(糖化學與生物技術(shù)教育部重點實驗室, 江南大學 藥學院, 江蘇 無錫 214122)

采用GC-MS聯(lián)合二維核磁的方法, 對文蛤均多糖結(jié)構(gòu)進行解析。運用雙酶輔助水提的方法, 提取文蛤粗多糖(MMPX), 分離純化得到文蛤均多糖, 并通過氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)和核磁共振波譜(1D, 2D NMR), 對文蛤均多糖的結(jié)構(gòu)進行了分析。結(jié)果表明, 從文蛤中提取得到文蛤粗多糖(MMPX), 經(jīng)分離純化得到高純度文蛤均多糖Fr.2A, 其單糖組成為葡萄糖(Glc)。GC-MS分析發(fā)現(xiàn), Fr.2A存在三種殘基單元1, 4-Glc、T-Glc和1, 4, 6-Glc, 摩爾比為5.58︰1.26︰1.0; 核磁共振波譜分析表明, Fr.2A是以-(1→4)與少量-(1→6)連接為主鏈, 并存在少量的-(1→6)和-(1→4)支鏈的新型水溶性D型吡喃葡聚糖。

GC-MS; 核磁共振; 多糖; 結(jié)構(gòu)解析

多糖參與多種生物生理活動, 如細胞間的識別及信息傳遞、生物體的生長發(fā)育和機體能量代謝等。現(xiàn)代研究已證明, 多糖具有多種生物活性, 如降血糖、抗凝血、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)功能等[1-4], 在醫(yī)藥開發(fā)領(lǐng)域具有廣泛的應用前景。多糖的功能與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān), 多樣性和特異性的結(jié)構(gòu)是其生物功能的基礎(chǔ)[5-7]。通過對多糖結(jié)構(gòu)的分析, 能夠找到其生物功能的依據(jù), 也是深入了解多糖作用機制的前提。由于多糖在糖基組成、連接方式、構(gòu)型和支化度上具有多樣性[8], 采用經(jīng)典方法解析結(jié)構(gòu)復雜的多糖仍具有較高難度[9]。隨著核磁共振技術(shù)的不斷發(fā)展, 尤其是高分辨率核磁圖譜及二維核磁分析方法的普遍應用, 為多糖結(jié)構(gòu)的精細解析提供了強有力的技術(shù)支持[10]。

文蛤(L.)是我國沿海潮間帶常見的蛤類, 不僅肉質(zhì)鮮美, 而且還具有很高的藥用價值, 具有清肺化痰, 軟堅散結(jié), 利水消腫, 制酸止痛, 斂瘡收濕和抗疲勞之功效[11]。文蛤的組織提取液對艾氏瘤型、肝癌腹水型和肝癌實體型有較高的抑制率[12]。已有較多研究認為[12-15], 文蛤多糖是文蛤中具有抑制腫瘤和免疫活性的一個重要成分。研究文蛤多糖的方向主要集中在提取方法和藥理活性評價, 而結(jié)構(gòu)方面相對較少。本實驗在進行文蛤多糖提取分離時, 發(fā)現(xiàn)不同提取方法所得的多糖組分的分子質(zhì)量和糖基的組成差異較大。為尋找更具活性價值的多糖組分, 需要對獲得的分離組分進行較為精細的結(jié)構(gòu)分析。本文以氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)結(jié)合二維核磁為主要手段, 對文蛤均多糖組分Fr.2A的結(jié)構(gòu)進行鑒定, 以期為多糖類化合物的結(jié)構(gòu)表征及構(gòu)效關(guān)系研究提供參考。

1 材料與實驗方法

1.1 材料

文蛤軟體, 購于南通昌華水產(chǎn)食品有限公司, –20℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

胰蛋白酶(2 500 U/mg), 木瓜蛋白酶(6 000 U/mg)購自國藥集團化學試劑有限公司; 右旋糖酐標準品購自sigma公司; 其他化學試劑均為國藥試劑公司的分析純。

1.3 儀器

SpectraMax酶標儀(美國Molecular Devices公司); 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司); 冷凍干燥機2.5 L Traid(美國LABCONCO公司); AKTA purifier 900蛋白純化系統(tǒng)(美國GE集團); DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱和Superdex G 75葡聚糖凝膠柱(美國GE集團); 高效凝膠滲透色譜儀HLC- 8320GPC EcoSEC(美國懷雅特技術(shù)公司); 三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀GC-MS TSQ8000(美國賽默飛世爾科技有限公司); 核磁共振波譜儀NMR 600M(德國布魯克AXS公司)。

1.4 文蛤多糖的提取及純化

采用雙酶法(胰蛋白酶和木瓜蛋白酶)輔助提取文蛤粗多糖[13]; 對文蛤粗多糖進行全波長掃描, 確定最適檢測波長; 采用兩步層析策略, 多糖進行分離純化, 分別為弱離子交換層析(DEAE-FF)和分子排阻層析(葡聚糖凝膠柱G75), 得到了組分Fr.2A。

1.5 單糖組成分析

采用離子色譜儀(ICS-5000型), 色譜柱為CarboPA20, 脈沖安培檢測器; 流動相分別采用水、250 nmol/L NaOH溶液、1 mol/L NaAc溶液, 流速0.5 mL/min。

1.6 分子質(zhì)量及純度檢測

高效凝膠滲透色譜法(HPGPC), 色譜儀為HLC- 8320 GPC EcoSEC, 色譜柱為Ultrahydroge Linear (300 mm×7.8 mm ID×2), 采用2410示差折光檢測器。流動相為0.1 mol/L NaNO3, 流速為0.8 mL/min; 采用Epower 色譜工作站和GPC軟件對多糖樣品平均分子質(zhì)量進行計算, 以右旋糖酐標準品進行曲線校正。

1.7 紅外光譜分析

取2 mg Fr.2A與KBr混合、研細、壓片, 在4 000~500 cm–1范圍內(nèi)進行掃描。

1.8 GC-MS分析

1.8.1 樣品預處理

采用改良的Hakomori法對樣品甲基化[16]: 先稱取經(jīng)P2O5干燥的樣品50 mg, 加入10 mL無水二甲亞砜, 攪拌使多糖充分溶解; 再加入200 mg干燥的NaOH粉末, 攪拌使之溶解, 反應1 h; 然而加入6 mL碘甲烷, 攪拌反應1 h, 最后加入2 mL水終止反應。反應全程通入氮氣進行保護。將反應液減壓蒸干去除有機試劑, 再使用去離子水透析24 h。將透析液濃縮、凍干。重復上述步驟3次。樣品采用紅外光譜檢測, 當其3 400 cm–1波長附近的羥基峰完全消失, 表示甲基化完成。

酸水解: 取5 mg甲基化樣品加入2 mL 體積分數(shù)90% 甲酸, 100℃水解6 h, 減壓蒸干, 加入3 mL甲醇再減壓蒸干, 重復3次。溶解于2 mL水中, 加入25 mg 硼氫化鈉室溫反應2 h, 滴加乙酸至溶液pH呈酸性, 減壓濃縮蒸干, 加3 mL甲醇和少量乙酸減壓蒸干, 重復此步驟4次, 最后一次不加乙酸。

乙酰化: 干燥后樣品加2 mL乙酸酐, 100℃衍生化1 h, 減壓蒸干, 反復加甲苯(3 mL)減壓蒸干, 重復3次; 再溶于氯仿中, 加3 mL水洗滌3次, 最后收集氯仿層用無水硫酸鈉干燥, 濃縮至0.3 mL, 得到了部分甲基化糖醇乙酸酯衍生物。

1.8.2 GC-MS檢測

采用毛細管色譜柱(HP-5, 0.25 mm×30 m); MSD檢測器; 色譜條件: 柱溫從140℃升至250℃, 2℃/min; 進口溫度: 250℃; 載氣: 氦氣; 載氣流速: 1.0 mL/min; 上樣量: 1 μL。

1.9 核磁共振分析

稱取干燥樣品80 mg, 用D2O(99.96%)溶解樣品, 凍干, 重復3次, 使樣品中的氫完全被氘氫置換; 再用500 μL D2O溶解, 轉(zhuǎn)移至核磁管中進行檢測, 在室溫下記錄一維NMR(1H-NMR、13C-NMR)和二維NMR(1H-1H COSY、HSQC、HMBC)圖譜[17-20]。

2 結(jié)果與討論

2.1 文蛤多糖的提取、分離純化及理化性質(zhì)分析

胰蛋白酶和木瓜蛋白酶雙酶法聯(lián)合水解文蛤軟體, 提取文蛤多糖[13], 得到文蛤粗多糖MMPX; 經(jīng)全波長掃描發(fā)現(xiàn), MMPX在215 nm處有吸收, 并經(jīng)苯酚硫酸法驗證為多糖組分, 因而采用該波長作為檢測波長。經(jīng)陰離子交換(DEAE-FF)柱初步分離, 并以0~0.4 mol/L濃度的NaCl溶液進行樣品洗脫, 得到了分離度良好的五個組分(圖1, Fr.1-5), 進一步對Fr.2組分進行凝膠色譜(Superdex G75)純化, 得到峰形對稱性較好的多糖組分Fr.2A(圖1, Fr.2A)。

經(jīng)高效凝膠過濾色譜法分析, Fr.2A平均分子質(zhì)量為882 kDa, 純度達到100%; 離子色譜法對其單糖組成分析表明, 主要由葡萄糖組成。因此, 可對Fr.2A進行結(jié)構(gòu)分析。

2.2 Fr.2A的 FT-IR 分析

Fr.2A在3406.43 cm–1處吸收為-OH伸縮振動; 1 153.41、1 079.83、1 023.84 cm–1處吸收是糖環(huán)C—O—C的特征骨架振動; 在2 926.06 cm–1和1 373.26 cm–1的吸收是C—H的伸縮振動和變角振動; 在929.21 cm–1處有吸收, 為D型吡喃環(huán)的伸縮振動; 849.53 cm–1處吸收, 是異頭端基的特征吸收。根據(jù)紅外光譜的上述特征吸收, 可以初步推測Fr.2A是主要由-D-吡喃糖組成的多糖。

圖1 文蛤多糖(Fr.2A)純化洗脫曲線

圖2 Fr.2A的FT-IR譜圖

2.3 Fr.2A的GC-MS分析

多糖經(jīng)甲基化、酸水解、乙?；? 可以得到甲基化的糖醇乙酸酯衍生物, 再利用GC-MS分析, 可以獲得有關(guān)單糖殘基的類型、糖環(huán)形式以及羥基的取代情況等多種結(jié)構(gòu)信息。Fr.2A經(jīng)上述衍生化, 其碎片離子峰經(jīng)由化學質(zhì)譜庫中檢索和分析, 可確定其由三種殘基組成: 1, 4-Glc、1, 4, 6-Glc和1-Glc, 三者的摩爾比約為5.58︰1︰1.26, 且都是吡喃型糖(表1)。1, 4-Glc含有2個連接點, 其相對百分含量高, 是糖鏈的主體, 而1, 4, 6-Glc也是位于主鏈結(jié)構(gòu)上的糖基, 且其6位存在支化連接; T-Glc包含了主鏈的末端糖基, 也包含了大量與主鏈6位連接的側(cè)位糖基。由此可以大致推測出Fr.2A是一條由1, 4糖苷鍵連接的線性多糖, 其主鏈存在6位修飾的葡萄糖, 但也并不能完全排除其他支鏈修飾的可能。

表1 Fr.2A 的甲基化分析結(jié)果

Tab.1 Result of Fr.2A methylation

2.4 Fr.2A的核磁分析

由于FT-IR譜圖在提供糖構(gòu)型解析上還不夠精確, 因此不能完全排除其他糖構(gòu)型的存在, 同時在上述衍生化分析時, 可能存在衍生不完全、碎片結(jié)構(gòu)單元丟失等問題, 因此, 要精確推測Fr.2A的結(jié)構(gòu), 還需要借助核磁共振波譜進一步確認, 具體是確認糖的與構(gòu)型。

2.4.1 糖基的構(gòu)型確定

在1H-NMR譜中, 大部分氫信號集中在3.0×10–6~ 4.0×10–6之間, 在此區(qū)域的譜峰重疊, 不易進行歸屬; 但異頭氫所在區(qū)域能夠獲得較好的分離度, 可作為糖構(gòu)型的重要判據(jù)。在Fr.2A的1H-NMR圖譜(圖3)中可以看到4個端基氫信號, 化學位移依次為5.35(A)、5.17(B)、4.92(C)和4.60(D), 其中A和B端基氫的化學位移>5.0×10–6, 可以確定其是來自-構(gòu)型的異頭氫, 而C、D端基氫的化學位移<5.0×10–6, 通常屬于-構(gòu)型; 但在多糖等復雜構(gòu)型的化合物中, 也有可能是-端基氫的高頻偏移, 需要通過二維核磁的近程相關(guān)譜(HSQC)耦合常數(shù)3JC, H進一步判斷, 其判定依據(jù)為:構(gòu)型3JC, H在170 Hz, 而構(gòu)型3JC, H在160 Hz左右。

圖3 Fr.2A的1H-NMR譜圖

HSQC反映的是異核單量子近程相關(guān), 可以確定的是同一位點的H與C的耦合關(guān)系, 根據(jù)從1H-1H COSY譜中已經(jīng)識別的氫的化學位移, 在HSQC譜找到與氫相連碳的化學位移。根據(jù)Fr.2A的HSQC譜圖(圖4)從已經(jīng)確定氫的化學位移推測出相連碳的化學位移, 對A(H1, C1)、B(H1, C1)、C(H1, C1)、D(H1, C1)、…、D(H6, C6)進行歸屬。通過HSQC圖譜中異頭碳與對應異頭氫的化學位移計算3JC, H耦合常數(shù), 其中C的3JC, H=170 Hz, D的3JC, H=160 Hz, 表明C為構(gòu)型, D為構(gòu)型。

圖4 Fr.2A的HSQC譜圖

多糖分子的一維碳譜(13C-NMR)中, 異頭碳的化學位移集中在90.00×10–6~112.00×10–6, 其中80.00×10–6~ 90.00×10–6區(qū)間為呋喃型糖環(huán)信號, 80.00×10–6~ 55.00× 10–6為C2-C6的信號區(qū), 一般情況下通過異頭碳信號數(shù)目來確定糖殘基數(shù)目, 異頭碳區(qū)域出現(xiàn)的信號為對應的或構(gòu)型。在Fr.2A的13C-NMR圖譜(圖5)中, 同樣存在4個異頭碳信號, 化學位移依次為99.59×10–6、98.61× 10–6、95.74×10–6和91.83× 10–6, 與一維氫譜中4個異頭氫相符, 說明存在4種糖殘基, 且都為吡喃型糖環(huán)(化學位移), 這與FT-IR和GC-MS結(jié)果相符。

圖5 Fr.2A的一維碳譜圖

2.4.2 連接方式確定

GC-MS的結(jié)果初步給出了Fr.2A的連接方式, 主要包括1, 4糖苷鍵連接和1, 6糖苷鍵兩種方式。如果能夠通過核磁圖譜獲得主要糖基C、H的化學位移, 就可以較為準確地推測出連接方式。

由異頭氫的化學位移出發(fā), 在二維氫-氫相關(guān)譜(1H-1H COSY)中找到與異頭氫交叉的信號峰和相鄰氫的耦合關(guān)系, 確定相鄰氫的化學位移, 依次可以找到其余的氫的化學位移; 根據(jù)已經(jīng)確定的氫的化學位移, 可以在HSQC中找到與相應氫化學位移交叉的信號峰, 確定與氫對應碳的化學位移。因此可對所有的碳和氫的化學位移進行歸屬(圖6、表2)。

HMBC反映的是異核遠程相關(guān)信息, 可以確定糖環(huán)之間的連接方式。根據(jù)Fr.2A的HMBC譜(圖7), 并結(jié)合氫與碳化學位移歸屬表(表2), 發(fā)現(xiàn)A-H1與A-C4, A-H1與C-C4, A-H1與C-H6, B-H1與C-H6, A-H4與A-C1, C-H4與A-C1, D-H1與C-C4, C-H4與D-C1具有相關(guān)耦合關(guān)系, 確定A與A之間通過1→4連接, A與C之間通過1→4, 1→6連接, D與C之間通過1→4連接, B與C之間通過1→6連接。

圖6 Fr.2A的1H-1H COSY譜圖

表2 Fr.2A的1H-NMR和13C-NMR化學位移信號歸屬

糖殘基異頭氫信號峰面積大小, 反映的是該殘基在多糖中含量的多少。對殘基異頭氫峰面積進行積分, 得到A︰(B+D)︰C=5.54︰1.21︰1.0, 這與GC-MS分析殘基比例相吻合, 其中B與D的峰面積比為1︰1。因此, 可以進一步確定殘基A為1, 4)--D-Glc, 殘基B為1)-- D-Glc, 殘基C為1, 4, 6)-- D-Glc, 殘基D為1)--D-Glc, 并可推斷出殘基A, B, C, D的最簡摩爾比為11︰1︰2︰1。因此, 多糖Fr.2A可能的結(jié)構(gòu)單元如圖8所示。

圖7 Fr.2A的HMBC譜

圖8 Fr.2A 的結(jié)構(gòu)單元

3 結(jié)論

本實驗采用GC-MS聯(lián)合二維核磁共振波譜(1H-1H COSY、HSQC、HMBC)的方法, 對文蛤多糖Fr.2A結(jié)構(gòu)進行解析, 發(fā)現(xiàn)Fr.2A是一種以-(1→4), 以及少量-(1→6)連接為主鏈, 并伴隨著少量-(1→ 6)和-(1→4)支鏈的新型水溶性D型吡喃葡聚糖。

動物體內(nèi)的以-(1→4)連接為主的多糖大多由糖原衍生而來, 其修飾方式通常-(1→6)葡聚糖的側(cè)鏈修飾, Fr.2A也屬這種類型, 但本文通過二維核磁圖譜的精確分析, 發(fā)現(xiàn)在側(cè)鏈糖基上還存在少量的-(1→4)葡聚糖進一步修飾, 使其結(jié)構(gòu)更為復雜。關(guān)于-(1→4)-D-Glc支鏈結(jié)構(gòu)的存在, 在海蟶、河蚌等來源的多糖中也有報道[20-21], 但之前研究并沒有明確。

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(本文編輯: 康亦兼)

The structure ofLinnaeus polysaccharide Fr.2A characterized by GC-MS and 2D NMR

HE Yong-feng, QIAN Jian-ying, LI Heng, LU Zhen-ming, XU Zheng-hong, SHI Jin-song

(Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, ministry of Education; School of Pharmaceutical Science, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In this study, the structure of a polysaccharide is analyzed using GC-MS combined with two-dimensional NMR. A polysaccharide from the clamLinnaeus (MMPX) was prepared using double enzyme- assisted water extraction, and its purity was analyzed and characterized using GC-MS and 1D and 2D NMR. The result showed that Fr.2A, extracted and purified fromLinnaeus, is a type of highly purified polysaccharide. The GC-MS analysis demonstrated that Fr.2A had three types of residue: 1, 4-Glc), T-Glc), and (1, 4, 6-Glc, and that the molar ratio of these residues was 5.58︰1.26︰1.0. The NMR spectrum results demonstrated that the main chain in Fr.2A was-(1→4) with a small amount of-(1→6) included, and that the branch was linked with less-(1→6) and-(1→4), which is a novel water-soluble D-glucan.

GC-MS; 2D NMR; polysaccharide; structural characterization

Mar. 20, 2017

R931

A

1000-3096(2017)10-0050-08

10.11759/hykx20170320003

2017-03-20;

2017-07-18

國家海洋公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目(201305007); 江蘇省重大科技成果轉(zhuǎn)化項目(BA2015006)

[National Marine public welfare industry research foundation of China, No.201305007; The transformation project for major scientific and technological achievements in Jiangsu Province, No.BA2015006]

何永峰(1989-), 男, 湖南道縣人, 碩士研究生, 主要從事海洋活性多糖相關(guān)的研究, E-mail.15061888901@163.com; 史勁松, 通信作者, 男, 教授, 主要從事酶工程及天然活性物質(zhì)開發(fā)研究, E-mail.shijs@163.com