龔 競(jìng)， 田 莎， 侯 勇， 趙歡歡， 朱 勇

(西南大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400716)

HCl和DMSO阻斷滯育條件下桑蠶卵殼電鏡觀察

龔 競(jìng)， 田 莎， 侯 勇， 趙歡歡， 朱 勇

(西南大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400716)

【目的】探討桑蠶Bombyxmori滯育阻斷機(jī)理，比較HCl、二甲基亞砜(DMSO)法阻斷蠶卵滯育后卵殼表面發(fā)生的一系列變化。【方法】用HCl和DMSO分別在產(chǎn)后20和12 h 處理蠶卵，利用掃描電鏡觀察卵殼表面及氣孔在處理后不同時(shí)間點(diǎn)的變化?！窘Y(jié)果】HCl和DMSO處理均能成功地阻斷蠶卵滯育的發(fā)生，蠶卵平均孵化率分別為93.37%和87.81%。掃描電鏡觀察HCl和DMSO處理的卵殼表面蝕刻效果明顯，均出現(xiàn)了“脂質(zhì)”脫落物；并且處理后蠶卵的氣孔有逐步增大的趨勢(shì)，與DMSO處理相比較，HCl處理獲得的現(xiàn)象更為明顯。【結(jié)論】卵殼表面變化可能與桑蠶滯育的阻斷有關(guān)。

桑蠶; 阻斷滯育; HCl; DMSO; 掃描電鏡; 卵殼

昆蟲(chóng)對(duì)不利環(huán)境的規(guī)避是其生存和廣泛繁殖的重要條件之一，滯育是其躲避不利條件增強(qiáng)適應(yīng)性的一種表現(xiàn)。不利條件規(guī)律性地出現(xiàn)，經(jīng)年累月會(huì)引起昆蟲(chóng)體內(nèi)的周期性變化，這種變化逐漸成為昆蟲(chóng)的遺傳特性[1]。因此，昆蟲(chóng)會(huì)出現(xiàn)某一世代某一蟲(chóng)態(tài)的發(fā)育停止；經(jīng)過(guò)一段時(shí)期或某一因子刺激后，才重新恢復(fù)發(fā)育[2]。昆蟲(chóng)的這一特性，使之成為世界上數(shù)量龐大、種類(lèi)眾多的生物群體。

桑蠶Bombyxmori是鱗翅目昆蟲(chóng)的模式生物之一，是卵滯育昆蟲(chóng)的典型代表[3-4]。在蠶業(yè)生產(chǎn)中，人們常在滯育卵產(chǎn)下后的適當(dāng)時(shí)期，通過(guò)一些物理、化學(xué)方法阻止蠶卵滯育，使蠶卵進(jìn)入活化狀態(tài)，在適當(dāng)?shù)臏囟?、濕度和光照條件下催青，孵化出蟻蠶(1齡幼蟲(chóng))再飼育。用HCl處理的即時(shí)浸酸法阻斷滯育是目前最常用的方法[5]。Yamamoto等[6]研究表明，二甲基亞砜(DMSO)及部分烷類(lèi)試劑也能不同程度地阻斷蠶卵進(jìn)入滯育,但鮮見(jiàn)被處理后卵殼的變化觀察。雖然人們?cè)谏a(chǎn)中發(fā)現(xiàn)了很多阻斷蠶卵進(jìn)入滯育的方法，但是阻斷滯育的機(jī)理迄今仍未完全闡明。

為了探究HCl和DMSO等阻斷桑蠶蠶卵進(jìn)入滯育的機(jī)理，本文利用掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)即時(shí)浸酸法和DMSO法處理后的蠶卵進(jìn)行了觀察，重點(diǎn)關(guān)注了卵殼表面和氣孔變化，比較處理組與對(duì)照組的差異，為阻斷滯育機(jī)理的研究提供線索。

1 材料和方法

1.1 材料

供試桑蠶：二化性桑蠶品種大造，由西南大學(xué)桑蠶基因庫(kù)提供。催青溫度為25 ℃，戊3胚子前為自然光照，戊3胚子后為每天18 h長(zhǎng)光照。收蟻后在25 ℃,光周期12 h光∶12 h暗條件下飼養(yǎng)幼蟲(chóng)、上簇營(yíng)繭、化蛹化蛾、交配，產(chǎn)下滯育卵。

1.2 方法

選用8個(gè)蛾圈做試驗(yàn)，每個(gè)蛾圈分成3份：即時(shí)浸酸處理、DMSO處理、不做任何處理(對(duì)照)。按照常規(guī)方法催青，孵化后調(diào)查統(tǒng)計(jì)孵化率。

1.2.1 蠶卵處理 DMSO處理：蠶卵產(chǎn)下后12 h，室溫25 ℃，DMSO溶液浸泡45 min，浸畢后流水洗凈，晾干[6]；HCl處理：蠶卵產(chǎn)下后20 h，室溫25 ℃，1.100 g·mL-1的HCl溶液浸泡70 min，浸畢后流水洗凈，晾干[7]。

1.2.2 電鏡樣品制備及觀察 2種方法處理的蠶卵和未處理的滯育卵，在產(chǎn)后的12(20)、48、72 h，5、9 d分別取樣，每次取20粒蠶卵，先用1×PBS緩沖液清洗，洗去卵殼表面附著物。采用戊二醛和鋨酸雙固定：取洗凈的蠶卵置于w為2.5%的戊二醛溶液4 ℃固定2 h，然后用1×PBS緩沖液漂洗3次，每次漂洗10 min；接著用w為1%的鋨酸溶液固定2 h后，用0.1 mol·L-1的PBS緩沖液漂洗3次，每次漂洗10 min。經(jīng)過(guò)雙固定的樣品，用乙醇和叔丁醇進(jìn)行梯度脫水。最后樣品在空氣中自然干燥。干燥好的樣品用導(dǎo)電膠粘貼在掃描電鏡的載物臺(tái)上，離子濺射儀鍍膜后用掃描電鏡(JCM-5000, NIKON)對(duì)蠶卵表面進(jìn)行觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將HCl、DMSO處理的蠶卵和未處理的滯育卵放入25 ℃、相對(duì)濕度75%的培養(yǎng)箱常規(guī)催青，統(tǒng)計(jì)蠶卵孵化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶卵的孵化率

HCl和DMSO處理10 d后蠶卵的孵化率調(diào)查結(jié)果見(jiàn)表1。8個(gè)蛾圈的蠶卵均正常孵化，統(tǒng)計(jì)項(xiàng)目中除蟻蠶的孵化率以外，還統(tǒng)計(jì)了轉(zhuǎn)青死卵數(shù)、未受精卵數(shù)等指標(biāo)。其他卵所占比例參照孵化率的統(tǒng)計(jì)。從表1數(shù)據(jù)可以看出，HCl阻斷滯育是成功的，孵化卵所占比例很高，達(dá)93.37%。結(jié)果顯示DMSO阻斷滯育也是成功的，蠶卵平均孵化率為87.81%。對(duì)照組蠶卵產(chǎn)下后放入25 ℃的培養(yǎng)箱，40～48 h開(kāi)始轉(zhuǎn)色，呈現(xiàn)淡赤豆色，之后顏色逐漸加深，變?yōu)槌喽股?、固有色?0 d后蠶卵幾乎不孵化，完全進(jìn)入滯育，統(tǒng)計(jì)結(jié)果詳見(jiàn)表1。

將HCl和DMSO處理的平均孵化率和對(duì)照組蠶卵平均孵化率進(jìn)行了對(duì)比，2種方法處理均能較好地阻斷滯育轉(zhuǎn)而活化蠶卵，孵化率均在87%以上，而對(duì)照的蠶卵絕大部分進(jìn)入滯育。

表1 HCl和DMSO處理后蠶卵的孵化率
Tab.1 The hatching rates of silkworm eggs treated by HCl or DMSO

區(qū)號(hào)孵化卵數(shù)/粒死卵數(shù)/粒轉(zhuǎn)青死卵數(shù)/粒未受精卵數(shù)/粒孵化率/%HClDMSO對(duì)照HClDMSO對(duì)照HClDMSO對(duì)照HClDMSO對(duì)照1)HClDMSO對(duì)照1120152200009030097．5694．412．1521321190300850110085．7195．9703152142100006020098．7095．950．684122112220052040091．7398．251．47513813300610000000100．0068．5606109940333040000093．9774．02079890134016040092．4590．000．6988635000056080086．8785．370

1)對(duì)照蠶卵區(qū)號(hào)1～8的滯育卵數(shù)分別為91、92、145、134、116、158、144、183粒。

2.4 HCl對(duì)蠶卵表面的刻蝕效果

HCl處理后不同時(shí)期的桑蠶卵殼表面掃描電鏡的結(jié)果如圖1所示。HCl處理后的卵殼表面具有明顯的刻蝕痕跡，卵殼表面有類(lèi)似“脂質(zhì)”脫落的表現(xiàn)，且產(chǎn)后20 h HCl溶液處理后立即就能觀察到，48 h樣品中觀察到大量“脂質(zhì)”脫落，72 h的樣品中盡管能觀察到一些脫落物，但是量明顯減少 (圖2A～2C) ；在對(duì)照組不同時(shí)期的蠶卵中，蠶卵表面均未能發(fā)現(xiàn)明顯的刻蝕現(xiàn)象(圖2D～2F)。此外，在HCl處理和對(duì)照組的卵殼表面都有少量白色裂痕出現(xiàn)。

A～C分別為HCl處理組產(chǎn)卵后20、48、72 h卵殼表面，D～F分別為對(duì)照組產(chǎn)卵后20、48、72 h卵殼表面，圖中寬箭頭示裂痕，窄箭頭示脫落的脂質(zhì)。

圖1 HCl處理后桑蠶卵殼表面電鏡觀察
Fig.1 SEM Observation on eggshell surface after HCl treatment

2.5 DMSO對(duì)蠶卵表面的刻蝕效果

在產(chǎn)后12 h DMSO處理后，從掃描電鏡的圖片可以看出，桑蠶卵殼具有明顯的刻蝕痕跡，有類(lèi)似“脂質(zhì)”的碎片分布在卵殼的表面。產(chǎn)后48 h觀察到大量的“脂質(zhì)”碎片脫落，72 h的樣品仍然能觀察到，而對(duì)照組中均未出現(xiàn)蝕刻的現(xiàn)象(圖2)。與HCl處理一樣，DMSO處理的桑蠶卵殼表面也觀察到了裂痕現(xiàn)象。

A～C分別為DMSO處理組產(chǎn)卵后12、48、72h卵殼表面,D～F分別為對(duì)照組產(chǎn)卵后12、48、72h卵殼表面,圖中寬箭頭示裂痕，窄箭頭示脫落的脂質(zhì)。

圖2 DMSO處理后桑蠶卵殼表面電鏡觀察
Fig.2 SEM observation on eggshell surface after DMSO treatment

2.6 HCl對(duì)蠶卵表面氣孔的影響

蠶卵氣孔的變化如圖3所示，HCl處理后的蠶卵氣孔明顯增大。對(duì)照滯育卵的氣孔與處理后的蠶卵起初差異并不大，但是隨著時(shí)間的推移，9 d后氣孔已經(jīng)顯著縮小，此時(shí)，對(duì)照組的蠶卵已經(jīng)完全進(jìn)入滯育，呼吸、代謝等顯著下降。

A～E分別為HCl處理組產(chǎn)卵后20、48、72 h和5、9 d卵殼氣孔，F(xiàn)-J分別為對(duì)照組產(chǎn)卵后20、48、72 h和5、9 d卵殼氣孔，白色箭頭示氣孔。

2.7 DMSO對(duì)蠶卵表面氣孔影響

DMSO處理組在產(chǎn)卵后48 h內(nèi)的卵殼氣孔變化不大，大約在產(chǎn)后72 h差異逐漸顯現(xiàn)，9 d時(shí)(孵化前)差異明顯。在卵產(chǎn)下12 h對(duì)照和處理的蠶卵氣孔幾乎無(wú)差異，此時(shí)對(duì)照組蠶卵還未進(jìn)入滯育，呼吸量跟活化蠶卵無(wú)差異。隨著時(shí)間的推移，對(duì)照組在9 d的時(shí)候氣孔顯著縮小，蠶卵已經(jīng)完全進(jìn)入滯育。就對(duì)卵殼氣孔的影響程度而言，與HCl處理相比較，DMSO處理略顯平緩。

A～E分別為DMSO處理組產(chǎn)卵后12、48、72 h和5、9 d卵殼氣孔,F～J分別表示對(duì)照組產(chǎn)卵后12、48、72 h和5、9 d卵殼氣孔,白色箭頭示氣孔。

圖4 DMSO處理后桑蠶卵殼氣孔電鏡觀察
Fig.4 SEM observation on eggshell aeropyle after DMSO treatment

3 討論和結(jié)論

本研究中HCl和DMSO處理桑蠶蠶卵分別獲得了93.37%和87.81%的平均孵化率，高于日本學(xué)者Yamamoto用DMSO處理的試驗(yàn)結(jié)果，在試驗(yàn)方法相同的情況下，可能是由供試蠶品種的不同造成的，Yamamoto的試驗(yàn)中樣本量是100～150粒蠶卵[6]，跟本研究的8個(gè)蛾圈，每個(gè)蛾圈大約110粒蠶卵的樣本量比較起來(lái)樣本偏小，這可能也是導(dǎo)致數(shù)據(jù)出現(xiàn)一定程度偏差的原因。有學(xué)者主張以轉(zhuǎn)青率作為衡量阻斷滯育是否成功的標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)榭赡苡性S多因素共同作用導(dǎo)致轉(zhuǎn)青卵不孵化[8]，這樣轉(zhuǎn)青率顯然高于孵化率。本試驗(yàn)表明2種方法均能成功阻斷滯育，為電鏡觀察提供了依據(jù)。

卵殼表面的電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，2種方法處理后的蠶卵表面都有“脂質(zhì)”脫落物出現(xiàn)。吳大洋[9-10]通過(guò)對(duì)卵殼脂質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)并鑒定了2種高級(jí)醇的乙酸酯，其在滯育卵和非滯育卵的卵殼中的含量存在顯著差異，滯育卵卵殼的脂質(zhì)含量明顯高于非滯育卵，并且在滯育卵的發(fā)育過(guò)程中2種乙酸酯的含量交替變化，推斷這些差異和變化是導(dǎo)致滯育的關(guān)鍵原因；更為重要的是，鹽酸處理會(huì)導(dǎo)致滯育卵2種乙酸酯含量顯著減少，促使蠶卵滯育被阻斷轉(zhuǎn)而活化。

關(guān)于DMSO阻斷滯育的機(jī)理，Yamamoto推測(cè)可能是通過(guò)卵殼滲透入蠶卵的某種化學(xué)物質(zhì)加強(qiáng)了酶抑制劑的運(yùn)輸能力，從而誘導(dǎo)活化[6]，但缺乏更多的試驗(yàn)證明。就本研究而言，HCl和DMSO處理對(duì)卵殼外部蝕刻作用是顯而易見(jiàn)的。此外，處理和對(duì)照的卵殼上均出現(xiàn)了裂痕，我們認(rèn)為這是在制片過(guò)程中蠶卵卵殼受到物理擠壓而出現(xiàn)的現(xiàn)象，與HCl和DMSO的處理沒(méi)有直接關(guān)系。

昆蟲(chóng)胚胎發(fā)育階段，氣孔作為氣體交換的重要通道，會(huì)隨著發(fā)育進(jìn)程有一系列變化。其中，最為典型的是氣孔直徑大小的變化。較大的家禽卵已有觀察到其卵殼氣孔隨胚胎的發(fā)育逐漸增大的報(bào)道[11-12]。昆蟲(chóng)中的相關(guān)研究大多是比較幾種昆蟲(chóng)卵殼外部形態(tài)特征的報(bào)道[13-14]，但對(duì)桑蠶等昆蟲(chóng)胚胎發(fā)育階段卵殼氣孔變化的報(bào)道較少。Woods等[15]研究了煙草天蛾Manducasexta卵殼氣孔的直徑大小及密度，其研究結(jié)果與本結(jié)果基本一致，即隨著胚胎的發(fā)育，卵殼氣孔逐漸增大。對(duì)其他昆蟲(chóng)和魚(yú)類(lèi)的研究表明氧氣的消耗量與滯育的終止有極其重要的聯(lián)系[16-17]，桑蠶卵的氧氣消耗量與山梨糖醇的利用率相關(guān)[18]。

本研究驗(yàn)證了Yamamoto關(guān)于烷類(lèi)試劑DMSO也能阻斷蠶卵滯育的研究，通過(guò)電鏡觀察了HCl和DMSO阻斷滯育后，蠶卵胚胎發(fā)育過(guò)程中卵殼表面出現(xiàn)脂質(zhì)脫落物和氣孔大小發(fā)生的變化。這些結(jié)果為探討滯育阻斷機(jī)理提供了生動(dòng)、形象的表觀特征，但這種現(xiàn)象與滯育阻斷的機(jī)制是否存在直接關(guān)系尚待更多的生理生化以及分子生物學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證。

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【責(zé)任編輯 霍 歡】

SEM observation on silkworm eggshell under HCl or dimethyl sulfoxide(DMSO) treatment for preventing diapause

GONG Jing, TIAN Sha, HOU Yong, ZHAO Huanhuan, ZHU Yong

(College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716, China)

【Objective】 To investigate the diapause prevention mechanism of silkworm (Bombyxmori)，and compare a series of changes of eggshell surface after diapause prevention by HCl or DMSO treatment. 【Method】The eggs were treated with HCl or DMSO at 20 and 12 h after oviposition respectively. Scanning electron microscope (SEM) was used to observe the changes of eggshell surface and aeropyle at different time points after treatment. 【Result】Both HCl and DMSO treatments successfully prevented the occurrence of egg diapause, and the average hatching rates were 93.37% and 87.81% respectively. SEM observation showed clear etching effect and “l(fā)ipid” shed on eggshell surface, and the aeropyle diameter increased gradually under both treatments. The above observations were more obvious for the HCl treatment compared with the DMSO treatment. 【Conclusion】Eggshell surface changes may be related to the diapause prevention of silkworm.

silkworm; diapause prevention; HCl; DMSO; scanning electron microscopy; eggshell

2016- 07- 11優(yōu)先出版時(shí)間：2017-01-10

龔 競(jìng)(1980—)，女，實(shí)驗(yàn)師，博士研究生，E-mail:03gongjing@163.com；通信作者：朱 勇(1961—)，男，教授，博士，E-mail: zhuy@swu.edu.cn

973計(jì)劃 (2012CB114600)；國(guó)家自然科學(xué)基金 (31201853) ；重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃(cstc2015jcyA0469)

S828

A

1001- 411X(2017)02- 0001- 05

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170110.1423.018.html

龔 競(jìng)， 田 莎， 侯 勇， 等.HCl和DMSO阻斷滯育條件下桑蠶卵殼電鏡觀察[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,38(2):1- 5.