陳展宇，王 闊，王曉梅，劉相國，崔喜艷

(1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 長春 130118； 2吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118； 3吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長春 130124)

玉米淀粉合成酶SSⅡa啟動子的克隆及功能分析

陳展宇1，王 闊2，王曉梅1，劉相國3，崔喜艷2

(1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 長春 130118； 2吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118； 3吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長春 130124)

【目的】克隆玉米Zeamays淀粉合成酶SSⅡa啟動子，并分析其功能，為進一步研究和應(yīng)用SSⅡa啟動子奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā客ㄟ^NCBI上公布的玉米基因組序列，在網(wǎng)站MaizeGDB上BLAST查找到SSⅡa 5′側(cè)翼序列，利用PCR方法從玉米B73中克隆SSⅡa啟動子；通過PlantCare在線分析啟動子順式作用元件，用特異性引物分別克隆出長度為1 407、867、633、483和365 bp的片段，與植物表達載體pCAMBIA3301連接，構(gòu)建5種5′缺失體的植物表達載體，命名為P1、P2、P3、P4和P5。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥Arabidopsisthaliana，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥?！窘Y(jié)果】 以玉米B73基因組DNA為模板，用特異性引物SSⅡaF/SSⅡaR進行擴增，得到2 526 bp序列；除草劑篩選的陽性擬南芥植株P(guān)CR驗證均檢測出gus基因；GUS組織化學(xué)分析表明，5種類型啟動子構(gòu)建的表達載體在成熟期葉片、果莢中均顯藍色；gus基因定量分析表明，成熟期5種轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中，gus基因表達量P1最高，其他基本一致；種子中g(shù)us基因表達量P1和P2相近，且高于P3、P4和P5。【結(jié)論】成功克隆玉米SSⅡa啟動子；構(gòu)建的5種SSⅡa啟動子缺失體表達載體在轉(zhuǎn)基因擬南芥中均具有活性，長度為1 407 bp(P1)和867 bp(P2)的啟動子具有胚乳特異性。

玉米； 淀粉合成酶； SSⅡa啟動子； 克??； 載體構(gòu)建； 功能分析

在基因工程相關(guān)研究中，對淀粉合成相關(guān)酶及基因方面的研究已經(jīng)取得了一定的進展[1]，但啟動子作為基因表達的重要調(diào)控區(qū)域，在淀粉相關(guān)研究中報道相對較少。選擇合適的啟動子是有目的地表達外源基因面臨的重要科學(xué)問題，也是培育安全、高效轉(zhuǎn)基因作物的首要問題[2]。淀粉是玉米Zeamays中的主要物質(zhì)，玉米中淀粉含量的高低直接影響玉米的產(chǎn)量[3]，直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例影響淀粉的品質(zhì)[4]，玉米淀粉是一種優(yōu)良并且可靠的淀粉來源，全世界80%淀粉來源于玉米[5]，玉米淀粉在化工、醫(yī)藥、紡織、造紙和建筑等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，淀粉的需求量在日益增加，因此提高玉米淀粉含量和改良玉米淀粉品質(zhì)已成為重要議題，對于玉米淀粉的研究具有顯著的社會效益和經(jīng)濟效益[6-7]。

淀粉是在胚乳造粉質(zhì)體中經(jīng)一系列酶的配合作用合成的，其中淀粉合成酶在其合成中起到?jīng)Q定性作用，可溶型淀粉合成酶主要包括SSⅠ、SSⅡ、SSⅢ[8-10]，其中SSⅠ和SSⅢ的表達已相繼被證明具有胚乳特異性。玉米淀粉合成酶SSⅡa是淀粉合成酶中的關(guān)鍵酶，能夠參與玉米支鏈淀粉的合成[11]，對其啟動子的研究有助于從調(diào)控水平上改善及改變SSⅡa活性及作用，進而實現(xiàn)增產(chǎn)及改良目的，完善淀粉代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的研究。

本研究克隆并分析SSⅡa啟動子，構(gòu)建5個缺失體植物表達載體，采用三親雜交法將目標質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌Agrobacteriumtumefacies，用蘸花法將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入擬南芥Arabidopsisthaliana，使用除草劑篩選獲得陽性植株。PCR檢測鑒定擬南芥陽性植株，采用GUS染色和gus基因定量分析啟動子的作用部位和活性，以期通過基因工程手段提高玉米淀粉含量，改良淀粉品質(zhì)提供候選特異性啟動子，并為玉米SSⅡa啟動子功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米B73種子由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所提供，盆栽砂培，取三葉期的葉片提取基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。植物表達載體pCAMBIA3301由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室保存。

基因組DNA提取試劑盒(Bio Teke)、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BglⅡ和LATaq均購自TaKaRa生物有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒為AxyGEN公司產(chǎn)品。

克隆SSⅡa基因所用上游引物SSⅡaF：5′-TGTCAGACTGGTTAGTGGAGC-3′；下游引物SSⅡaR：5′-AGAAGGTGGAGGAAGAGGACG-3′。

構(gòu)建不同長度啟動子表達載體的上游引物如下：

SSⅡaF1：5′-CGGAATTCCCTTGACTGGCATCCTT-CCTA-3′，

SSⅡaF2：5′-CGGAATTCTAGAAAGATGTCCCAC-AGAGA-3′，

SSⅡaF3：5′-CGGAATTCTAGCCTATGCTTACCTT-TCAG-3′，

SSⅡaF4：5′-CGGAATTCACGCCATTTTCCATCGT-GCCA-3′，

SSⅡaF5：5′-CGGAATTCCTCGCTGGGCTGCCGTA-GGTA-3′，

共同的下游引物為SSⅡaR：5′-GAAGATCTGG-CGGCGGGATCGATCG-3′。

下劃線分別為EcoR I(GAATTC)和BglⅡ(AGATCT)的酶切位點序列。

gus基因檢測所用上游引物GUS-F：5′- TTCCTGATTAACCACAAACC-3′；下游引物GUS-R：CGGTTCGTTGGCAATACTCC。

gus基因的定量分析所用β-Actin內(nèi)參基因上游引物Actin-F：5′-TGCCAATCTACGAGGGTTTC-3′；下游引物Actin-R：5′- GCTCTGCTGTTGTGGTGAAC-3′；目的gus基因上游引物qGUS-F:5′-CTCACACCG-ATACCATCAGC-3′;下游引物qGUS-R：5′-TACCTT-CTCTGCCGTTTCCA-3′。

1.2 SSⅡa啟動子的克隆及序列分析

利用試劑盒提取玉米B73三葉期葉片基因組DNA，根據(jù)玉米數(shù)據(jù)庫(http://www.maizegdb.org.ssr/)公布信息，BLAST找到SSⅡa基因5′側(cè)翼序列，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計克隆引物SSⅡaF和SSⅡaR，采用常規(guī)PCR方法擴增SSⅡa基因5′側(cè)翼序列，PCR條件為：95 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s，69.7 ℃ 40 s，72 ℃ 150 s，35個循環(huán)；72 ℃，15 min。擴增產(chǎn)物連接到pMD-18T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α，挑取單菌落經(jīng)PCR鑒定后送至上海生工生物工程公司測序，測序結(jié)果與已知序列比對后，利用PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)啟動子在線分析軟件分析及預(yù)測啟動子順式作用元件等功能元件信息[12]。

1.3 SSⅡa啟動子植物表達載體的構(gòu)建

克隆的SSⅡa啟動子經(jīng)序列分析后，依據(jù)功能元件所在位置，設(shè)計5對引物SSⅡaF1和SSⅡaR、SSⅡaF2和SSⅡaR、SSⅡaF3和SSⅡaR、SSⅡaF4和SSⅡaR、SSⅡaF5和SSⅡaR，并在上下游引物兩側(cè)分別加上EcoRⅠ和BglⅡ酶切位點，擴增SSⅡa啟動子序列的長度分別為1 407、867、633、483和365 bp，用于構(gòu)建5個不同長度SSⅡa啟動子缺失的植物表達載體[13]。擴增5種長度啟動子序列的退火溫度分別為56.5、56.5、56.5、62.9和62.9 ℃。將PCR產(chǎn)物與植物表達載體pCAMBIA3301分別雙酶切后，16 ℃過夜連接，構(gòu)建5種重組載體(命名為：P1、P2、P3、P4和P5)，分別轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，挑取經(jīng)PCR及酶切驗證后的陽性克隆菌液，送至上海生工生物工程公司測序。

1.4 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

哥倫比亞型擬南芥，農(nóng)桿菌EHA105和含HELP質(zhì)粒菌株均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室提供，德國泥炭土、蛭石、MS鹽、SilwetL-77、6-芐氨基嘌呤(6-BA)、B5維生素、蔗糖、利福平(Rif)抗生素、Kan抗生素等試劑，以及LB培養(yǎng)基和YEP培養(yǎng)基均購置于上海生工生物工程公司。

三親雜交法將重組植物表達載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，植物材料培養(yǎng)于人工氣候室，擬南芥長至開花期采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法侵染擬南芥，收獲種子，種植，用除草劑篩選陽性植株，作為功能驗證試驗材料[13]。

1.5 SSⅡa啟動子在擬南芥中的功能分析

1.5.1gus基因的PCR檢測 提取含5種不同類型啟動子的轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株(以非轉(zhuǎn)基因擬南芥為對照)的葉片基因組DNA，以其為模板，植物表達載體pCAMBIA3301上的gus基因為目標基因設(shè)計的引物(GUS-F,GUS-R)進行PCR擴增，序列長度為402 bp，經(jīng)10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5.2 轉(zhuǎn)基因植株的GUS組織化學(xué)分析 分別取轉(zhuǎn)P1、P2、P3、P4和P5載體的陽性植株和野生型擬南芥，成熟期后分別取葉片和果莢進行GUS染色，參照Jefferson方法[14](略有改動)，具體步驟包括：

1)清洗：使用無菌水清洗樣品，去除樣品表面雜物；

2)染色：將材料放置培養(yǎng)皿中，使樣品完全浸入到GUS染色液中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜；

3)脫色：將染色材料置于體積分數(shù)為80%的乙醇溶液中脫色，期間視乙醇溶液顏色及時更換乙醇溶液，直至擬南芥材料完全脫色(綠色褪去，呈現(xiàn)白色)。脫色后的材料拍照觀察，記錄。

1.5.3gus基因的定量分析 提取上述不同試驗材料成熟期葉片和種子的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板，以β-Actin基因為內(nèi)參，實時熒光定量PCR法測定gus基因的表達，3次重復(fù)，采用2-ΔΔCt法進行分析，計算gus基因的相對表達量[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSⅡa啟動子克隆及分析結(jié)果

用玉米B73基因組DNA為模板，SSⅡaF, SSⅡaR為引物進行克隆，得到2 526 bp序列(見圖1A)，與pMD18T連接，轉(zhuǎn)化后搖菌，菌液PCR驗證結(jié)果如圖1B所示，將驗證好的陽性克隆測序表明，獲得的2 526 bp中有1個堿基突變，與參考序列比對一致性為99.96%，經(jīng)PlantCare軟件分析表明此堿基的差異并未在啟動子功能元件處，不影響啟動子的功能。

M：DL2000 DNA Marker；1～3：SSⅡa 啟動子。

Fig.1 Electrophoresis results of SSⅡa promoter cloning and PCR amplification

核酸測序結(jié)果及功能元件分析結(jié)果如圖2所示，經(jīng)PlantCare軟件分析發(fā)現(xiàn)，SSⅡa序列含有眾多啟動子必需的順式作用元件，具體元件信息如表1所示，其中包括TATA-box，CAAT-box等元件。該序列存在9個TATA-box，離SSⅡa基因ATG最近的為處于504 bp處的TATA-box(圖2紅色方框中顯示)，除此之外，分析還發(fā)現(xiàn)了眾多重要的功能元件和結(jié)合位點(表1)，例如1)MBS：MYB結(jié)合位點，能夠響應(yīng)水分、鹽、低溫等逆境脅迫；2)Skn-1-motif和GCN4-motif：胚乳表達所需的順式作用元件；3)motif IIb：參與脫落酸響應(yīng)的功能元件；4)O2-site：參與玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控的功能元件。這些功能元件的存在，說明玉米SSⅡa基因能夠受到多種生物及非生物脅迫的誘導(dǎo)及影響，而且擁有胚乳特異性表達的功能元件。該啟動子相關(guān)功能元件的研究，對于玉米SSⅡa基因的表達調(diào)控途徑的探究及開發(fā)胚乳特異型啟動子具有重要意義。

附有黃色底紋的序列為相關(guān)順式作用元件，由上至下紅色方框內(nèi)依次為克隆突變堿基、胚乳特異性表達功能元件、參與抗旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點、TATA-box、SSⅡa基因起始密碼子ATG。

圖2 玉米SSⅡa啟動子的序列分析
Fig.2 Sequence analysis of maize SSⅡa promoter

表1 SSⅡa啟動子區(qū)順式作用元件
Tab.1 Cis-acting elements of SSⅡa promoter

元件名稱序列元件功能元件位置CAAT?boxCAATT、CAAAT、CAAT啟動子和增強子區(qū)常見的順式作用元件-2380、-1094、-2088、-1165、-1377、-1166、-1095、-1915、-2013、-1032、-815CAT?boxGCCACT與分生組織表達相關(guān)的作用元件-1225、-546、-127CE3GACGCGTGTC參與ABA和VP1響應(yīng)的作用元件-2430CG?motifCCATGGGG光響應(yīng)元件-1945G?boxCACATGG光響應(yīng)元件-1601、-392I?boxGGATAAGGTG光響應(yīng)元件-2419MBSCGGTCAMYB結(jié)合位點-2452Skn?1?motifGTCAT胚乳表達所需的作用元件-1497、-1087GCN4?motifCAAGCCA胚乳表達調(diào)控作用元件-875Sp1CC(G/A)CCC光響應(yīng)元件-1279、-1145TATA?boxTAATA、TATA、ATATAA、核心啟動子元件(在轉(zhuǎn)錄起始位點上游)-1850、-2028、-1389、-1847、-1931、-1848、-2030、-529、-508TC?richrepeatsATTTTCTCCA參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的作用元件-1815TGA?elementAACGAC生長素響應(yīng)的作用元件-1256、-247TGACG?motifTGACG參與茉莉酸甲酯響應(yīng)的作用元件-2458、-1198、-754ABRECACGTG參與脫落酸響應(yīng)的元件-392CGTCA?motifCGTCA參與茉莉酸甲酯響應(yīng)的作用元件-213GARE?motifTCTGTTG赤霉素應(yīng)答作用元件-1029HSEAAAAAATTTC參與熱脅迫應(yīng)答的作用元件-824MBSCAACTG參與抗旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點-1000、-761O2?siteGATGATGTGG參與玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控的作用元件-1044motifIIbCCGCCGCGCT脫落酸響應(yīng)元件-796

2.2 SSⅡa啟動子功能元件分析及構(gòu)建缺失體設(shè)計

本研究成功克隆了玉米淀粉合成酶啟動子SSⅡa的2 526 bp片段，并利用PlantCare軟件對其進行分析[16]，針對此片段上的順式作用元件分別設(shè)計了5種5′缺失載體，其中：構(gòu)建缺失體P1中含有8個常見順式作用元件(CAAT)，3個與分生組織表達相關(guān)的元件CAT-box，3個茉莉酸甲酯響應(yīng)的元件CGTCA-motif和TGACG-motif，3個光響應(yīng)元件GAG-motif和SP1，1個赤霉素應(yīng)答元件GARE-motif，2個胚乳表達相關(guān)作用元件GCN4-motif和Skn-1 motif，1個熱響應(yīng)作用元件HSE，2個參與抗旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點MBS，1個參與玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控的作用元件O2-site，2個TATA-box，2個生長素響應(yīng)元件TGA-element，1個脫落酸響應(yīng)元件motif IIb。

缺失體P2包括2個常見順式作用元件(CAAT)，2個與分生組織表達相關(guān)的元件CAT-box，2個茉莉酸甲酯響應(yīng)的元件CGTCA-motif和TGACG-motif，1個光響應(yīng)元件GAG-motif，1個熱響應(yīng)作用元件HSE，1個參與抗旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點MBS，2個TATA-box，1個生長素響應(yīng)元件TGA-element，1個脫落酸響應(yīng)元件motif IIb。

缺失體P3包括2個與分生組織表達相關(guān)的元件CAT-box，1個茉莉酸甲酯響應(yīng)的元件CGTCA-motif，2個TATA-box，1個生長素響應(yīng)元件TGA-element。

缺失體P4包括1個與分生組織表達相關(guān)的元件CAT-box，1個茉莉酸甲酯響應(yīng)的元件CGTCA-motif，1個生長素響應(yīng)元件TGA-element。

缺失體P5包括1個與分生組織表達相關(guān)的元件CAT-box，1個茉莉酸甲酯響應(yīng)的元件CGTCA-motif，1個生長素響應(yīng)元件TGA-element，P4與P5功能元件相同但P5與P4相比缺少預(yù)測到的轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)序列。

2.3 不同長度SSⅡa啟動子5′缺失體植物表達載體構(gòu)建

根據(jù)SSⅡa啟動子分析結(jié)果，分別使用設(shè)計的缺失體引物進行PCR擴增，擴增結(jié)果如圖3A所示。采用EcoRⅠ、BglⅡ分別對5種不同長度SSⅡa啟動子的PCR產(chǎn)物和植物表達載體pCAMBIA3301進行雙酶切，分別構(gòu)建了5個缺失體植物表達載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細胞后，以菌液為模板進行菌液PCR驗證(圖3B)，分別提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證，結(jié)果見圖3C。說明不同長度SSⅡa啟動子植物表達載體構(gòu)建成功，分別命名為：pCAMBIA-3301-P1、pCAMBIA-3301-P2、pCAMBIA-3301-P3、pCAMBIA-3301-P4和pCAMBIA-3301-P5，以下簡稱為P1、P2、P3、P4和P5。

A：基因擴增 B：重組載體PCR驗證 C：雙酶切驗證

M：DL2000 DNA Marker；1～5分別為缺失體P1、P2、P3、P4和P5。

圖3 不同長度SSⅡa啟動子片段的擴增、重組載體PCR驗證及雙酶切驗證結(jié)果

Fig.3 Amplification of SSⅡa promoter fragments of different length, PCR verification of recombinant vectors and double enzyme digestion verification

2.4 SSⅡa啟動子在擬南芥中的功能分析

2.4.1gus基因的PCR檢測 用除草劑噴灑擬南芥，獲得的抗性植株分別提取基因組DNA，以其為模板，gus基因為目標基因進行PCR檢測，結(jié)果見圖4，由缺失體P1～P5均擴增出402 bp的條帶，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏臄U增結(jié)果為陰性，證明所采樣的擬南芥均為成功轉(zhuǎn)化不同長度啟動子的陽性植株。

M：DL2000 DNA Marker；1～2為缺失體P5，3～4為缺失體P4 ，5～6為缺失體P3，7～8為缺失體P2，9～10為缺失體P1；CK：非轉(zhuǎn)基因?qū)φ铡?/p>

圖4 不同表達載體gus基因PCR擴增驗證電泳結(jié)果

Fig.4 PCR detection results ofgusgene in different expression vectors by electrophoresis

2.4.2 轉(zhuǎn)基因植株的GUS組織化學(xué)分析 在成熟期階段，分別采取葉片和果莢為試驗材料進行GUS染色，結(jié)果見圖5，野生型擬南芥(CK)葉片未見藍色，5種類型不同轉(zhuǎn)啟動子的擬南芥葉片均呈現(xiàn)不均勻藍色；野生型擬南芥果莢未見藍色，轉(zhuǎn)基因擬南芥果莢均有藍色，且不同長度啟動子的果莢，藍色深淺不同，P1和P2果莢染色較深，P3、P4和P5果莢染色較淺。

圖5 成熟期轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片和果莢GUS組織化學(xué)染色

Fig.5 Histochemical analysis of GUS activities in leaves and pods of transgenicArabidopsisthalianaplant at maturity

2.4.3gus基因的定量分析 轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)組織化學(xué)染色分析后，可以初步判斷啟動子驅(qū)動的gus基因的表達部位和大致表達強度，但并不能判斷啟動子的活力大小，為了進一步明確5種啟動子的活性，利用熒光定量PCR技術(shù)從轉(zhuǎn)錄水平上檢測各啟動子驅(qū)動的gus基因的表達情況，圖6所示為成熟期5種轉(zhuǎn)基因植株葉片和種子gus基因相對表達量。由圖6可知，野生型擬南芥(CK)葉片和種子中g(shù)us基因均不表達，這與GUS染色結(jié)果一致。5種轉(zhuǎn)基因葉片中，gus基因表達量P1最高，其他基本一致。種子中g(shù)us基因P1和P2表達量相近，高于P3、P4和P5，P5表達量最低。P1和P2中含有胚乳特異性表達的功能元件。本研究結(jié)果表明，缺失胚乳表達功能元件可導(dǎo)致所驅(qū)動的gus基因在種子中表達量下降(P3、P4和P5)。SSⅡa啟動子具有的胚乳特異性，種子gus基因表達量差異可能與功能元件的數(shù)量有關(guān)[16]。

圖6 成熟期轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片和種子中g(shù)us基因的相對表達量

Fig.6 Relative expression levels ofgusgene in leaves and seeds of transgenicArabidopsisthalianaplant at maturity

3 討論與結(jié)論

2009年玉米基因組測序工作的完成，為玉米功能基因及啟動子序列的克隆帶來了極大的方便。本試驗利用玉米淀粉合成酶基因SSⅡa核酸序列，BLAST分析出SSⅡa5′上游DNA序列，設(shè)計特異引物，利用常規(guī)PCR方法克隆了2 526 bpSSⅡa基因5′側(cè)翼序列，與NCBI中公布的玉米基因組序列比對后，一致性為99.96%。

目前，對玉米SSⅡa啟動子的研究報道較少[17]，但Harn等[8]1998年最先從玉米胚乳中成功的克隆了zmSSⅡa和zmSSⅡb的cDNA，SSⅡa在玉米淀粉代謝網(wǎng)絡(luò)中也主要在胚乳中行使功能，參與支鏈淀粉的合成；任紅麗等[18]與Hu等[19]分別鑒定了玉米可溶性淀粉合成酶基因的SSⅠ和SSⅢ啟動子均為胚乳特異性啟動子；Li等[20]研究表明秈稻SSⅡa 啟動子為胚乳特異性啟動子。以上研究結(jié)果預(yù)示本研究克隆的玉米SSⅡa 啟動子可能具有胚乳特異性。

本研究結(jié)果經(jīng)PlantCare在線分析軟件分析，發(fā)現(xiàn)其除具有典型啟動子基本順式作用元件之外，還含有胚乳特異性表達功能元件，抗旱誘導(dǎo)結(jié)合位點，光誘導(dǎo)元件等脅迫誘導(dǎo)順式作用元件。為了研究部分順式作用元件的功能，構(gòu)建了5個缺失體載體，主要研究胚乳特異性功能元件、抗旱誘導(dǎo)MYB結(jié)合位點等的功能。重新設(shè)計5種類型的引物，擴增SSⅡa啟動子序列的長度分別為1 407 bp(P1)、867 bp(P2)、633 bp(P3)、483 bp(P4)和365 bp(P5)，用于構(gòu)建5個不同長度SSⅡa啟動子缺失的植物表達載體，分別轉(zhuǎn)化擬南芥，通過基因組PCR檢測，均擴增出402 bp的條帶，可證明所采樣的擬南芥均為成功轉(zhuǎn)化不同長度啟動子的陽性植株。利用GUS化學(xué)法對轉(zhuǎn)基因陽性擬南芥成熟期葉片和果莢進行染色，初步驗證了gus基因表達部位和大致表達強度；通過熒光定量技術(shù)對轉(zhuǎn)基因陽性擬南芥成熟期葉片和種子進行g(shù)us基因定量表達，證明了長度為1 407 bp(P1)和867 bp(P2)的SSⅡa啟動子具有胚乳特異性。

本研究對5種啟動子的功能比較分析只是初步結(jié)果，利用P1和P2聯(lián)合考察胚乳特異性功能元件的作用，對其功能的深入探討，如利用P2和P3聯(lián)合考察抗旱誘導(dǎo)MYB結(jié)合位點的作用，利用P3和P4聯(lián)合考察啟動子中TATA序列是否為此啟動子行使功能的TATA-box等功能的深入研究，還有待后續(xù)實驗驗證。通過對以上5種啟動子缺失體功能的進一步研究，期望能夠明確SSⅡa啟動子中部分順式作用元件的功能，為SSⅡa啟動子的應(yīng)用提供理論依據(jù)，為組織特異性啟動子的開發(fā)和應(yīng)用提供候選啟動子，為玉米淀粉代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的研究提供基礎(chǔ)。

[1] MüLLER-R?BER B T, KOβMANN J, HANNAH L C, et al. One of two different ADP-glucose Pyrophosphorylase genes from potato responds strongly to elevated levels of sucrose[J]. Mol Gen Genet, 1990, 224(1): 136-146.

[2] NAOMI S S, ICHIRO M. Constitutive promoters available for trans-gene expression instead of CaMV35S RNA promoter:Arabidopsispromoters of tryptophan synthase protein subunit and phytochrome B[J]. Plant Biotechnol-nar, 2002, 19(1): 19-26.

[3] 覃鴻妮，蔡一林，孫海燕，等.種植密度對不同株型玉米蔗糖代謝和淀粉合成相關(guān)酶活性的影響[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，18(6):1183-1188.

[4] 崔喜艷，胡廣宇，孫小杰，等.1個新的玉米半透明皺縮胚乳突變體的遺傳分析及基因定位[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，35(5) :31-35.

[5] 張軍杰，黃玉碧.玉米可溶性淀粉合成酶研究進展[J].玉米科學(xué)，2006，14(6):151-154.

[6] 王振華，亢偉民，張新.高淀粉玉米及其開發(fā)利用[J].玉米科學(xué)，2002，10(3):90-92.

[7] 彭澤斌，田志國.高淀粉玉米的產(chǎn)業(yè)化潛力分析[J].作物雜志，2003(6):10-12.

[8] HARN C, KNIGHT M, RANAKRISHNAN A, et al. Isolation and characterization of the zSSIIa and zSSIIb starch synthase cDNA clones from maize endosperm[J]. Plant Mol Biol, 1998, 37(4): 639-649.

[9] KNIGHT M E, HARN C, LILLEY C E, et al. Molecular cloning of starch synthase I from maize (W64) endosperm and expression inEscherichiacoli[J]. Plant J, 1998, 14(5): 613-622.

[10]GAO M, WANAT J, STINARD P S, et al. Characterization ofdull1, a maize gene coding for a novel starch synthase[J]. Plant Cell, 1998, 10(3): 399-412.

[11]BLAUTH S L, YAO Y, KLUCINEC J D, et al. Identification of mutator insertional mutants of starch-branching enzyme 2a in corn[J]. Plant Physiol, 2001, 125(3): 1396-1405.

[12]相恒佐.毛百合GPAT基因啟動子的克隆和功能鑒定[D].沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014:15-16.

[13]佟珊珊.根特異性啟動子表達AAP1-bar雙價基因在玉米新材料創(chuàng)制中的應(yīng)用研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[14]JEFERSON G, RLCARDO J.S, ARTHUR G F, et al. Iron homeostasis related genes in rice[J].Genet Mol Biol，2003, 26(4): 477-497.

[15]THOMAS D S, KENNETH J L. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method[J].Nature, 2008, 3(6): 1101-1108.

[16]崔喜艷，陳眾峰，范貝，等.栽培大豆rbcS啟動子的克隆及在轉(zhuǎn)基因煙草中功能缺失分析[J]西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報，2015, 43(5): 114-121,128.

[17]曾禮華，汪瀚宇，謝程程，等.玉米淀粉合成酶基因GBSS啟動子的克隆與鑒定[J].植物生理學(xué)報，2015，51 (9): 1433-1439.

[18]任紅麗，黃玉碧.玉米淀粉合成酶Ⅰ基因(zsS1)啟動子載體構(gòu)建及胚乳瞬時表達[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[19]HU Y F, LI Y P, ZHANG J, et al. PzsS3a, a novel endosperm specific promoter from maize (ZeamaysL.) induced by ABA[J]. Biotechnol Lett，2011,33(7):1465-1471.

[20]LI Q F, SUN S S, LIU Q Q. Characterization of the spatial and temporal expression of theOsSSII-3 gene encoding a key soluble starch synthase in rice[J].J Sci Food Agr, 2013,93(13):3184-3190.

【責(zé)任編輯 莊 延】

Cloning and function analysis of starch synthase SSⅡa promoter in maize

CHEN Zhanyu1, WANG Kuo2, WANG Xiaomei1, LIU Xiangguo3, CUI Xiyan2

(1 Faculty of Agronomy, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2 College of Life Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 3 Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130124, China)

【Objective】 To clone maize (Zeamays) starch synthase SSⅡa promoter, analyze its function, and provide a basis for its future research and application. 【Method】 The SSⅡa 5′ flanking sequence was found on Maize GDB by BLASTing the maize genome sequence published on NCBI, and the SSⅡa promoter was cloned from maize B73 using PCR. We analyzed the cis elements of the promoter using PlantCare. Fragments of 1 407, 867, 633, 483, and 365 bp were cloned with specific primers, and were inserted into the plant expression vector pCAMBIA3301, respectively. Five plant expression vectors with different 5′ deletions of the SSⅡa promoter were constructed and named P1, P2, P3, P4 and P5.The transgenicArabidopsisthalianaplants were obtained throughAgrobacterium-mediated transformation. 【Result】 A DNA fragment of 2 526 bp was obtained by PCR amplification with maize B73 genome DNA as template and SSⅡaF/SSⅡaR as specific primers. The positiveA.thalianaplants, which were screened by herbicide, hadgusgene by PCR detection. The histochemical analysis of GUS showed that the expression vectors of five promoters were blue in leaves and pods at maturity. The quantitative analysis ofgusgene showed that among five transgenicA.thalianaat maturity, the expression level of P1 in leaves was the highest and the others were basically the same, and the expression levels of P1 and P2 in seeds were similar, both being higher than those of P3, P4 and P5. 【Conclusion】 The maize SSⅡa promoter has been successfully cloned. The five constructed expression vectors with different 5′ deletions of the SSⅡa promoter all have activities in transgenicA.thaliana, and the promoters with the length of 1 407 bp (P1) and 867 bp (P2) have endosperm specificity.

maize; starch synthesis enzyme; SSⅡa promoter; cloning; vector construction; function analysis

2016- 07- 31優(yōu)先出版時間：2016-12-28

陳展宇(1972—)，男，副教授，博士，E-mail: chenzhanyu2000@sina.com；通信作者：崔喜艷(1971—)，女，教授，博士，E-mail: cuixiyan2005@163.com

國家自然科學(xué)基金(31200611)；吉林省應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點實驗室開放課題(20130102066JC)；轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2014ZX0801004B)

S513

A

1001- 411X(2017)01- 0015- 08

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20161228.0937.028.html

陳展宇，王 闊，王曉梅，等.玉米淀粉合成酶SSⅡa啟動子的克隆及功能分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2017,38(1):15- 22.