李 丹，柳 陽(yáng)，翟艷花，顧澤茂

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070；2.淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070；3.農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070)

洪湖碘泡蟲(chóng)PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用

李 丹1, 2, 3，柳 陽(yáng)1, 2, 3，翟艷花1, 2, 3，顧澤茂1, 2, 3

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070；2.淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070；3.農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070)

為建立一種靈敏、特異的快速檢測(cè)異育銀鯽寄生洪湖碘泡蟲(chóng)(Myxobolushonghuensis)的方法，本研究根據(jù)洪湖碘泡蟲(chóng)ITS-5.8S rDNA基因序列篩選出一對(duì)特異性引物MhF/R，建立PCR檢測(cè)方法，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)特異性試驗(yàn)、靈敏性試驗(yàn)與臨床檢測(cè)驗(yàn)證其可行性。結(jié)果顯示，建立的PCR檢測(cè)方法能特異性擴(kuò)增洪湖碘泡蟲(chóng)相應(yīng)的基因片段，長(zhǎng)度為479 bp，而對(duì)試驗(yàn)中其他9種粘孢子蟲(chóng)的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；最低能檢測(cè)0.1 pg的蟲(chóng)體基因組DNA。通過(guò)臨床樣品檢測(cè)，PCR方法比顯微鏡檢測(cè)的檢出率提高了19.5%。結(jié)果表明，該P(yáng)CR方法特異、靈敏，適用于洪湖碘泡蟲(chóng)的快速檢測(cè)。

洪湖碘泡蟲(chóng)(Myxobolushonghuensis)；ITS-5.8S rDNA；PCR檢測(cè)；顯微鏡檢測(cè)

異育銀鯽(CarassiusauratusgibelioBloch)自上世紀(jì)80年代被成功篩選培育，具有生長(zhǎng)快、易飼養(yǎng)、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，是我國(guó)重要的鯽魚(yú)養(yǎng)殖品種。隨著異育銀鯽養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，病害問(wèn)題日趨嚴(yán)重，尤其是粘孢子蟲(chóng)病，嚴(yán)重威脅著異育銀鯽的苗種培育和成魚(yú)養(yǎng)殖，已成為制約異育銀鯽產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸因素[1-2]。目前，超過(guò)50種粘孢子蟲(chóng)種類寄生于異育銀鯽[3-7]，危害最嚴(yán)重的為異育銀鯽“喉孢子蟲(chóng)病”的病原體—洪湖碘泡蟲(chóng)(Myxobolushonghuensis)[5]?；疾◆~(yú)體主要表現(xiàn)為喉部紅腫發(fā)炎，不食而消瘦，游動(dòng)遲緩，眼球外凸，鰓絲腫脹，鰓蓋外鼓而無(wú)法閉合，易缺氧等。洪湖碘泡蟲(chóng)病的流行季節(jié)為每年5-10月，5-7月為病害高發(fā)期，主要流行于湖北、江蘇、沈陽(yáng)等多個(gè)地區(qū)，感染率可達(dá)60%，死亡率最高可達(dá)100%。目前洪湖碘泡蟲(chóng)的檢測(cè)主要以顯微鏡下可見(jiàn)成熟孢子、肉眼可見(jiàn)孢囊為依據(jù)，而一旦粘孢子蟲(chóng)在魚(yú)體內(nèi)形成成熟的孢子或孢囊，藥物很難滲入成熟孢子堅(jiān)硬的幾丁質(zhì)外殼。因此，有必要建立一種簡(jiǎn)單快速的早期檢測(cè)方法，在其營(yíng)養(yǎng)體階段進(jìn)行藥物防治，為診斷和預(yù)防洪湖碘泡蟲(chóng)病提供技術(shù)支持。

目前，洪湖碘泡蟲(chóng)的檢測(cè)方法主要有三種：(1)以顯微鏡觀察成熟孢子為基礎(chǔ)的形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法，雖然操作簡(jiǎn)便，但存在檢測(cè)滯后、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、效率低、易于漏檢等問(wèn)題[8]；(2)以抗原與抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫學(xué)檢測(cè)方法，雖然具有靈敏性高、能進(jìn)行早期檢測(cè)的特點(diǎn)，但由于粘孢子蟲(chóng)生活史中存在期、屬特異性抗原以及共同抗原，交叉反應(yīng)嚴(yán)重，增加了種特異性檢測(cè)的難度[9-12]；(3)以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法具有較高的特異性與靈敏性，運(yùn)用最為廣泛[13-16]。賈洛[17]以洪湖碘泡蟲(chóng)為抗原制備的抗體能與多種粘孢子蟲(chóng)發(fā)生交叉反應(yīng)；顧偉[18]根據(jù)洪湖碘泡蟲(chóng)的18S rDNA基因建立了巢式PCR方法，靈敏性較高，然而該方法的特異性還有待檢驗(yàn)。因此，亟需建立一種快速準(zhǔn)確、靈敏性高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法。核糖體DNA(rDNA)中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS(包括ITS1與ITS2)屬于非編碼序列，所受的選擇壓力較小，進(jìn)化速度快，具有可變性[19]，常與保守度較高的編碼序列5.8S rDNA共同作為靶標(biāo)應(yīng)用于相似物種的區(qū)別與鑒定中。本研究以洪湖碘泡蟲(chóng)的ITS-5.8S rDNA為靶基因篩選了一對(duì)特異性引物，建立了針對(duì)洪湖碘泡蟲(chóng)的特異性檢測(cè)方法，并初步應(yīng)用于臨床檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與保存

本試驗(yàn)中使用的洪湖碘泡蟲(chóng)(M.honghuensis)、吳李碘泡蟲(chóng)(M.wulii)、丑陋圓形碘泡蟲(chóng)(M.turpisrotundus)、倪李碘泡蟲(chóng)(M.nielii)、武漢單極蟲(chóng)(Thelohanelluswuhanensis)、龜殼單極蟲(chóng)(T.testudines)、多涅茨尾孢蟲(chóng)(Henneguyadoneci)、吉陶單極蟲(chóng)(T.kitauei)、山東碘泡蟲(chóng)(M.shantungensis)、野鯉碘泡蟲(chóng)(M.koi)等粘孢子蟲(chóng)樣本均由本實(shí)驗(yàn)室自行采集與保存。2015年7月從湖北省武漢市東西湖區(qū)養(yǎng)殖池塘隨機(jī)采集36尾異育銀鯽，體長(zhǎng)為3.0～12.4 cm，實(shí)驗(yàn)魚(yú)用撒網(wǎng)捕撈，將魚(yú)體放入充氧袋運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，暫養(yǎng)于水族箱中。

1.2 主要試劑

Marker DL2000、Loading Buffer 與PCR體系試劑(10×PCR Buffer(Mg2+free)、Mg2+、dNTP Mixture、Taq DNA聚合酶)均購(gòu)于寶生物工程有限公司；動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；TA克隆試劑盒(載體pMD19-T)購(gòu)自寶生物工程有限公司。

1.3 基因組DNA的提取

蟲(chóng)體基因組DNA的提取：將實(shí)驗(yàn)室保存于乙醇中的帶有粘孢子蟲(chóng)孢囊樣品取出，剪取小塊置于干凈的載玻片中，去除多余的宿主組織，室溫放置15-20 min或放入烘箱3-5 min，使乙醇揮發(fā)。將組織樣品或孢囊剪碎移入EP管中，充分研磨，再用蒸餾水沖洗、離心，反復(fù)幾次得到均勻組織或孢囊溶液備用。將待檢測(cè)的樣品移入500 μL細(xì)胞裂解液中(100 mol/L氯化鈉，10 mol/L Tris，10 mol/L EDTA，0.2% SDS，1 mg·mL-1蛋白酶K)，55 ℃水浴過(guò)夜，使用通用型動(dòng)物組織DNA提取試劑盒提取蟲(chóng)體的基因組DNA，具體步驟按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，提取后的DNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

檢測(cè)樣品基因組DNA的提取：分別剪取每尾異育銀鯽的皮膚、鰓、咽及肝胰臟的部分組織，共約50 mg，混合在一起，置于研缽中，剪碎并加入液氮充分研磨，然后采用動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取樣品的總DNA，提取后的DNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物篩選

通過(guò)比對(duì)與分析各粘孢子蟲(chóng)的ITS1-5.8S-ITS2基因序列，利用Primer 5.0軟件根據(jù)洪湖碘泡蟲(chóng)的ITS1與ITS2基因的差異序列分別設(shè)計(jì)上游與下游引物，其中，上游引物MhF：5’-TGATCATTGTGTGTTCATCAAGTC-3’，下游引物MhR：5’-TCGTAAAAATGACCTCTACTTTATAC-3’，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為479 bp。引物由武漢奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.5 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

1.5.1 退火溫度的優(yōu)化

以洪湖碘泡蟲(chóng)蟲(chóng)體基因組DNA為模板進(jìn)行溫度梯度試驗(yàn)，設(shè)定溫度梯度為：55 ℃、56 ℃、57 ℃、58 ℃、59 ℃、60 ℃，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定引物的最佳退火溫度。

1.5.2 Mg2+濃度的優(yōu)化

以洪湖碘泡蟲(chóng)蟲(chóng)體基因組DNA為模板進(jìn)行Mg2+濃度梯度試驗(yàn)，設(shè)定Mg2+終濃度為：0.5 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L、2.5 mol/L、3.0 mol/L、3.5 mol/L、4.0 mol/L，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定Mg2+的最佳濃度。

1.5.3 循環(huán)數(shù)的優(yōu)化

以洪湖碘泡蟲(chóng)蟲(chóng)體基因組DNA為模板進(jìn)行PCR循環(huán)數(shù)梯度試驗(yàn)，設(shè)定PCR循環(huán)數(shù)為：25循環(huán)、30循環(huán)、35循環(huán)、40循環(huán)，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定反應(yīng)最佳循環(huán)數(shù)。

1.6 特異性試驗(yàn)

根據(jù)優(yōu)化后的反應(yīng)體系與條件，以洪湖碘泡蟲(chóng)、吳李碘泡蟲(chóng)、丑陋圓形碘泡蟲(chóng)、倪李碘泡蟲(chóng)、武漢單極蟲(chóng)、龜殼單極蟲(chóng)、多涅茨尾孢蟲(chóng)、吉陶單極蟲(chóng)、山東碘泡蟲(chóng)、野鯉碘泡蟲(chóng)及健康異育銀鯽的DNA作為模板，同時(shí)以滅菌ddH2O為模板作為空白對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)該方法的特異性。

1.7 靈敏性試驗(yàn)

將洪湖碘泡蟲(chóng)的蟲(chóng)體DNA經(jīng)10倍倍比稀釋，分別得到8個(gè)不同濃度的DNA(10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6ng/μL)，每個(gè)反應(yīng)同時(shí)加入100 ng宿主DNA，以稀釋后的不同濃度的粘孢子蟲(chóng)DNA與宿主DNA的混合物作為模板，以滅菌ddH2O為模板作為空白對(duì)照，用篩選的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)該方法的靈敏性。

1.8 臨床樣品檢測(cè)

利用顯微鏡鏡檢法與PCR方法同時(shí)對(duì)36份樣品進(jìn)行洪湖碘泡蟲(chóng)的檢測(cè)。顯微鏡檢測(cè)：刮取魚(yú)體皮膚粘液，提取魚(yú)體鰓、咽、肝臟部分組織進(jìn)行壓片觀察，計(jì)算洪湖碘泡蟲(chóng)成熟孢子的檢出率。PCR檢測(cè)：按照優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系與條件對(duì)樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，根據(jù)目的條帶大小判定結(jié)果；擴(kuò)增之后，隨機(jī)抽取三個(gè)陽(yáng)性樣品，切膠回收，純化PCR產(chǎn)物，參照pMD19-T克隆試劑盒的操作步驟對(duì)目的DNA片段進(jìn)行連接與轉(zhuǎn)化。經(jīng)過(guò)PCR篩選得到陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆菌液送往武漢奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)定的序列經(jīng)人工校對(duì)、拼接并確認(rèn)無(wú)誤之后，在NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行序列比對(duì)，進(jìn)一步驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR反應(yīng)優(yōu)化結(jié)果

PCR反應(yīng)的優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖1。退火溫度在55～60 ℃范圍內(nèi)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶都比較亮，無(wú)明顯差異，而引物的退火溫度為57 ℃，因此選擇57 ℃為最佳退火溫度(圖1)。Mg2+濃度在1.0～2.5 mol/L范圍內(nèi)，擴(kuò)增條帶較亮，綜合考慮擴(kuò)增效果與試劑成本，最終選擇1.5 mol/L為最佳Mg2+濃度(圖2)。循環(huán)數(shù)為30、35、40時(shí)，擴(kuò)增條帶清晰明亮，綜合考慮擴(kuò)增效果與試驗(yàn)時(shí)間，最終選擇35次作為最佳循環(huán)數(shù)(圖3)。綜上，優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系為：DNA擴(kuò)增模板50 ng，10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+1.5 mol/L，dNTPs 1.0 mol/L，TaqDNA聚合酶1 U，Mh F/R各200 nM，滅菌ddH2O補(bǔ)足至25 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

圖1 退火溫度優(yōu)化Fig.1 Optimization of annealing temperatureM: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～6: 退火溫度依次為55 ℃, 56 ℃, 57 ℃, 58 ℃, 59 ℃, 60 ℃; 7: 空白對(duì)照.

圖2 鎂離子濃度優(yōu)化Fig.2 Optimization of MgCl2 concentrationM: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～8: 鎂離子濃度依次為0.5 mol/L,1.0 mol/L, 1.5 mol/L, 2.0 mol/L, 2.5 mol/L, 3.0 mol/L, 3.5 mol/L, 4.0 mol/L; 9: 空白對(duì)照.

圖3 循環(huán)數(shù)優(yōu)化Fig.3 Optimization of cycle numberM:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～5:循環(huán)數(shù)依次為20, 25, 30, 35, 40次;6:空白對(duì)照.

2.2 特異性試驗(yàn)

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，只有以洪湖碘泡蟲(chóng)DNA為模板才能擴(kuò)增出單一的目的條帶，而其他的粘孢子蟲(chóng)均無(wú)條帶擴(kuò)增(圖4)，說(shuō)明建立的洪湖碘泡蟲(chóng)PCR檢測(cè)方法特異性良好。

圖4 PCR特異性試驗(yàn)Fig.4 The specificity test of PCRM: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1: 洪湖碘泡蟲(chóng);2: 吳李碘泡蟲(chóng);3: 丑陋圓形碘泡蟲(chóng);4: 倪李碘泡蟲(chóng);5: 武漢單極蟲(chóng);6: 龜殼單極蟲(chóng);7: 多涅茨尾孢蟲(chóng);8: 吉陶單極蟲(chóng);9: 山東碘泡蟲(chóng);10: 野李碘泡蟲(chóng);11: 健康鯽魚(yú);12: 空白對(duì)照.

2.3 試驗(yàn)的靈敏性

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在宿主DNA干擾的情況下，洪湖碘泡蟲(chóng)模板濃度為10-4ng(0.1 pg)時(shí)仍能擴(kuò)增出條帶，因此，確定建立的PCR方法對(duì)洪湖碘泡蟲(chóng)最低檢測(cè)限為0.1 pg，靈敏性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 PCR靈敏性試驗(yàn)Fig.5 The sensitivity test of PCRM: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～8分別為10, 1, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 ng洪湖碘泡蟲(chóng)DNA + 100 ng宿主DNA; 9: 空白對(duì)照.

2.4 臨床初步應(yīng)用

利用顯微鏡鏡檢法與PCR方法同時(shí)對(duì)采集的36份樣品進(jìn)行洪湖碘泡蟲(chóng)的臨床檢測(cè)，結(jié)果顯示顯微鏡鏡檢法檢測(cè)洪湖碘泡蟲(chóng)成熟孢子(圖6)的陽(yáng)性檢出率為22.2 %(8/36)，PCR方法檢測(cè)洪湖碘泡蟲(chóng)的陽(yáng)性檢出率為41.7%(15/36)，比鏡檢法的高19.5個(gè)百分點(diǎn)。隨機(jī)抽取的三個(gè)陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物與洪湖碘泡蟲(chóng)的ITS-5.8S rDNA基因序列的相似度為99.6%～99.9%，表明建立的PCR檢測(cè)方法實(shí)用性強(qiáng)，可用于異育銀鯽寄生洪湖碘泡蟲(chóng)的臨床檢測(cè)。

圖6 洪湖碘泡蟲(chóng)成熟孢子, 標(biāo)尺=10 μm.Fig.6 Photomicrograph of mature spores of M. honghuensis, scale bar =10 μm.

3 討論

在粘孢子蟲(chóng)的早期分子檢測(cè)中，18S rDNA是運(yùn)用最為廣泛的分子標(biāo)記[20-23]，然而，18S rDNA序列比較保守，在同屬近緣種類間相似度較高，難以區(qū)分。其中，洪湖碘泡蟲(chóng)與吳李碘泡蟲(chóng)的18S rDNA相似度就高達(dá)93%，差異堿基分布分散，難以根據(jù)其18S rDNA基因進(jìn)行區(qū)別鑒定，因此迫切需要尋找其他合適的分子靶標(biāo)。ITS是介于核糖體DNA上18S、5.8S、28S 基因之間的一段高度可變區(qū)域，具有種間變異與種內(nèi)穩(wěn)定的特點(diǎn)[24]，已作為一種有效的分子標(biāo)記被廣泛運(yùn)用于寄生蟲(chóng)近緣物種的分子檢測(cè)中，但在粘孢子蟲(chóng)檢測(cè)方面運(yùn)用較少，目前只有Woo 等[25]利用ITS基因?qū)Ω腥觉幠c道的單極蟲(chóng)T.kitauei與T.hovorkai進(jìn)行了有效的區(qū)別與鑒定。通過(guò)序列比對(duì)與分析，發(fā)現(xiàn)洪湖碘泡蟲(chóng)的ITS包含較多的差異序列，因此，本研究選擇洪湖碘泡蟲(chóng)的ITS為靶基因建立了PCR檢測(cè)方法。

在建立PCR檢測(cè)方法的過(guò)程中，引物的篩選至關(guān)重要。特異性試驗(yàn)中只有洪湖碘泡蟲(chóng)擴(kuò)增出單一目的條帶，而其他粘孢子蟲(chóng)種類的擴(kuò)增結(jié)果呈陰性，證明篩選的引物特異性良好。靈敏性試驗(yàn)中，在宿主DNA的干擾下，檢測(cè)靈敏度仍達(dá)到了pg級(jí)檢測(cè)水平，說(shuō)明該方法的靈敏性較高。一般PCR方法的靈敏性試驗(yàn)僅僅用寄生蟲(chóng)的蟲(chóng)體基因組DNA為模板檢測(cè)，而忽略了宿主DNA的干擾，是一種分析靈敏性試驗(yàn)，而本研究在每個(gè)反應(yīng)中加入一定量的宿主DNA，結(jié)果更接近實(shí)際的診斷靈敏性。許多研究表明，PCR檢測(cè)方法比傳統(tǒng)顯微鏡鏡檢方法的靈敏性更高[13, 14]，本研究以這兩種方法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)與比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR方法的陽(yáng)性檢出率比鏡檢高19.5百分點(diǎn)，表明PCR的靈敏性更高。由于粘孢子蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)體形態(tài)多種多樣，且易與魚(yú)體組織結(jié)構(gòu)相混淆[11]，因此本研究以觀察到成熟孢子為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算檢出率，但檢測(cè)結(jié)果會(huì)低于實(shí)際的感染率。在顯微鏡檢測(cè)中，有1個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，能觀察到成熟的孢子，但數(shù)量較少，而對(duì)應(yīng)的PCR檢測(cè)呈陰性，類似的現(xiàn)象在國(guó)外粘孢子蟲(chóng)的檢測(cè)中也有過(guò)相關(guān)的報(bào)道[22]。另外，三個(gè)隨機(jī)樣品的測(cè)序結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確性高，適用于洪湖碘泡蟲(chóng)的臨床診斷。

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(責(zé)任編輯：張瀟峮)

Development and preliminary application of PCR method for the detection of Myxobolus honghuensis (Myxosporea: Bivalvulida)

LI Dan1,2,3, LIU Yang1,2,3, ZHAI Yan-hua1,2,3, GU Ze-mao1,2,3

( 1.DepartmentofAquaticAnimalMedicine,CollegeofFisheries,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China;2.FreshwaterAquacultureCollaborativeInnovationCenterofHubeiProvince,Wuhan430070,China; 3.KeyLabofFreshwaterAnimalBreeding,MinistryofAgriculture,Wuhan430070,China)

To establish a sensitive, specific and rapid method for detection ofMyxobolushonghuensisinfecting allogynogenetic gibel carpCarassiusauratusgibelio(Bloch), a single PCR method was developed with primers MhF/R targeting on its ITS-5.8S rDNA gene. After optimizating the reaction condition and system, a series of experiments on specificity and sensitivity were conducted. Additionally, 36 field samples were tested by the established PCR and microscopic examination. The results showed that the developed PCR method was specific to amplify a 479 bp fragment using genomic DNA fromM.honghuensiswith a detection limit of 0.1 pg, and no cross-reactions with other 9 myxosporean species tested. The clinical detection rate was 19.5% higher than that of microscopic examination. The results suggest that the present PCR method is an efficient approach for molecular detection ofM.honghuensisbecause of its specificity and sensitivity.

Myxobolushonghuensis; ITS-5.8S rDNA; PCR detection; microscopic examination

2016-05-22；

2016-09-21

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31572233)

李 丹(1991- )，女，碩士，專業(yè)方向?yàn)樗鷦?dòng)物醫(yī)學(xué)。E-mail: liyidan1991@163.com

顧澤茂。E-mail: guzemao@mail.hzau.edu.cn

S917

A

1000-6907-(2017)01-0012-05