劉 玲，王 靜，劉沐辰，慎會娜，花昌林

一氧化氮(nitric oxide,NO)是一種普遍存在的水溶性自由基氣體，在各種生理及病理過程中發(fā)揮著十分重要的作用[1-3]。研究表明，高濃度NO可通過抑制血管生成和轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)細胞凋亡等機制抑制腫瘤細胞增殖[4-6]。NO供體是指在體內(nèi)經(jīng)酶或非酶作用釋放NO的化合物，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種結(jié)構(gòu)類型的NO供體，如機硝酸酯類、亞硝基硫醇、呋咱氮氧化合物和偶氮鎓二醇鹽等，其中偶氮鎓二醇鹽類在靶向性釋放NO方面優(yōu)勢明顯[7-9]。O2-(2,4-二硝基苯基)1-[(4-乙氧羰基)哌嗪-1-yl]偶氮-1-鎓-1,2-二醇(JS-K)是一種新型偶氮鎓二醇鹽類衍生物，是在偶氮二醇鹽O2端以硝基芳香取代基進行取代[10-11]。本組前期研究顯示：JS-K對體外多種肝癌細胞(HepG2、SMMC-7721、Bel-7402)的增殖均有較強的抑制作用，可通過增加Ca2+水平，升高Bax/Bcl-2比值，激活caspase通路等機制誘導(dǎo)細胞凋亡[12]。本研究將以H22腹水瘤細胞和H22荷瘤小鼠為研究對象，分別從體外和體內(nèi)實驗，進一步觀察JS-K對H22腹水瘤細胞和腫瘤生長的抑制作用，為該化合物的應(yīng)用提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1動物、試劑和主要儀器健康雄性Balb/c小鼠40只，體質(zhì)量(20±2) g，由河南科技大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(鄂)2010-0007，將小鼠飼養(yǎng)在室溫18～25 ℃，光照12 h，相對濕度45%～55%，通風良好的環(huán)境中，喂普通飼料自由飲水。JS-K(純度≥97%，分子量384)，美國Santa Cruz公司。氟尿嘧啶注射液(10 mL：0.25 g，批號100605，上海旭東海普藥業(yè)有限公司)。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase，AST)測試盒購自南京建成生物工程研究所。Bcl-2、Bax和cleaved-caspase-3兔多克隆抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記羊抗兔 IgG為武漢三鷹生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他化學試劑均為分析純。ZS-板式酶標儀(美國Molecular Device公司)。

1.2動物及分組體外傳代培養(yǎng)的H22細胞用無菌生理鹽水配成1×107·mL-1的濃度。取0.2 mL接種于小鼠的腹腔，在小鼠腹腔內(nèi)常規(guī)傳代3次代以后，選擇腹水飽滿的小鼠抽取腹水，按照1∶3的比例用生理鹽水稀釋制成瘤細胞混懸液，調(diào)整細胞濃度為1×107·mL-1。每只0.2 mL接種在小鼠的右側(cè)腋窩皮下。接種次日，稱重，將小鼠隨機分成5組，每組8只，分為空白對照組、模型組、5-Fu陽性藥對照組(20 mg·kg-1)、JS-K 低劑量組(0.75 mg·kg-1)和JS-K高劑量組(1.50 mg·kg-1)?？瞻讓φ战M和模型組尾靜脈注射生理鹽水，每3 d給藥1次；5-FU組腹腔注射，每天給藥1次；JS-K給藥組尾靜脈注射，每3 d給藥1次，連續(xù)14 d。期間每天記錄各組小鼠的體質(zhì)量、進食量和生存狀態(tài)。

1.3腫瘤抑制率計算腋窩接種后第15天以脫頸椎法處死小鼠，完整取出右側(cè)腋窩皮下的瘤組織，準確稱質(zhì)量(g)，計算腫瘤抑制率。抑瘤率(%)=(模型組平均瘤質(zhì)量—給藥組平均瘤質(zhì)量)/ 模型組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.4血清ALT、AST檢測第15天處死小鼠前，眼眶取血，離心取上清，按試劑盒說明書步驟進行操作，比色法檢測并計算血清中ALT和AST的含量。

1.5Western蛋白印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白水平將瘤組織剪碎，加裂解液裂解提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量。用12% SDS-PAGE電泳分離總蛋白，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，加入一抗(稀釋倍數(shù)1∶1 000)于封閉袋中4 ℃孵育過夜；二抗室溫孵育 2 h。ECL化學發(fā)光法顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照并對蛋白條帶進行半定量分析。以目的蛋白條帶積分吸光度值與內(nèi)參條帶吸光度值的比值表示目的蛋白相對含量。

2 結(jié)果

2.1JS-K對H22荷瘤小鼠瘤質(zhì)量的影響體內(nèi)實驗顯示，腫瘤接種前各組小鼠活動正常，食欲良好。實驗中后期，小鼠日進食量、活潑度均有所下降，荷瘤模型組最為明顯，小鼠反應(yīng)遲緩，體型瘦小，毛色有黏連，不光滑，有脫毛現(xiàn)象。荷瘤模型組平均瘤質(zhì)量為(1.62±0.12) g，5-Fu 組移植瘤生長受抑制，5-FU組瘤質(zhì)量為(0.65±0.11)g，抑瘤率60.02%。JS-K實驗組平均瘤質(zhì)量明顯小于荷瘤模型組，JS-K治療組低劑量組瘤質(zhì)量為(1.23±0.15) g(P<0.05)，抑瘤率23.93%；JS-K高劑量組移植瘤生長抑制更加明顯，移植瘤生長較為局限，質(zhì)地稍硬，包膜較為完整。高劑量組瘤質(zhì)量為(0.81±0.16) g(P<0.05)，抑瘤率50.26%。結(jié)果JS-K能顯著抑制H22移植瘤小鼠體內(nèi)腫瘤的生長，見圖1。

①與模型組比較，P<0.05。圖1 JS-K對H22荷瘤小鼠移植瘤質(zhì)量的影響

2.2JS-K對H22荷瘤小鼠ALT和AST的影響JS-K給藥14 d后，與正常對照組相比，JS-K對H22荷瘤小鼠血清中ALT和AST水平?jīng)]有顯著影響，提示JS-K對小鼠肝臟沒有損傷作用，見表1。

表1 JS-K對H22荷瘤小鼠ALT和AST的影響

注：ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST：天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶。

2.3JS-K對H22荷瘤小鼠凋亡相關(guān)蛋白的影響與模型組比較，JS-K能降低腫瘤組織中抗凋亡蛋白Bcl-2表達，升高促凋亡蛋白Bax表達，同時使caspase-3剪切形式(活化)cleaved-casapse-3蛋白表達增加，提示JS-K可激活促進凋亡發(fā)生的相關(guān)通路，見圖2和圖3。

圖2 JS-K對H22荷瘤小鼠瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

A：各組Bcl-2表達比較；B：各組Bax表達比較；C：各組cleaved-casapse-3表達比較。①與模型組比較，P<0.05。圖3 H22荷瘤小鼠瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白比較

3 討論

由于NO的半衰期很短，為提高體內(nèi)NO濃度，所以對其前體藥的研究日益增多，其中NO供體藥偶氮烯翁二醇鹽類具有半衰期長的特點，可明顯提高放療療效和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。為解決NO供體靶向作用這一難題，應(yīng)該針對體內(nèi)特定酶進行研究，以期該酶能識別或活化的NO供體，或者是開發(fā)對特定組織具有高度親和力的NO供體[13-15]。JS-K作為偶氮翁二醇鹽類衍生物顯示了對多種腫瘤的抗腫瘤效應(yīng)，可在谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transfarase,GST)催化下，被谷胱甘肽的親核性巰基攻擊，生成偶氮鎓二醇鹽離子，在生理條件下偶氮鎓二醇鹽離子分解釋放NO[16-18]。研究發(fā)現(xiàn)JS-K可選擇性地在急性髓性白血病HL-60細胞內(nèi)釋放NO，殺滅癌細胞，而不傷害正常細胞，對免疫缺陷型小鼠體內(nèi)植入的HL-60細胞及前列腺癌細胞PC-3，JS-K均能抑制其生長，且不導(dǎo)致小鼠血壓下降等副作用[19-20]。

藥物在體外敏感性試驗是直接作用于細胞，但往往與體內(nèi)實驗效果并不一定完全相符。而且，藥物的活性成分在體內(nèi)受多種因素的影響，并且通過肝、腎器官可使藥物療效增強或減弱，因此體內(nèi)抗腫瘤實驗結(jié)果是評價抗腫瘤藥物有效性的重要指標。H22荷瘤小鼠肝癌細胞皮下移植模型是用于研究抗腫瘤藥物及篩選藥物作用機制的腫瘤模型。本研究分別通過體外細胞實驗和體內(nèi)移植瘤實驗觀察了JS-K的抗腫瘤作用。Ren等[21]發(fā)現(xiàn)JS-K可抑制Hep3B肝癌細胞的增殖，這與ERK、JNK和p38及其下游效應(yīng)c-Jun和AP-1的激活有關(guān)。NO清除劑可取消JS-K對MAPK的激活和腫瘤抑制作用。

本研究中，通過尾靜脈注射給藥的方式觀察了JS-K對小鼠移植H22腫瘤生長的抑制作用。結(jié)果顯示：與模型組相比，JS-K能顯著抑制小鼠 H22實體瘤的生長，對移植瘤的重量都有較明顯的抑制作用。其中荷瘤模型組小鼠平均瘤質(zhì)量為(1.62±0.12) g ，超過1 g，表示造模成功，腫瘤生長良好。JS-K低、高給藥組可在不同程度上抑制腫瘤的生長，而且對肝臟功能影響較小。

細胞凋亡是細胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的自主的有序的死亡。凋亡是多基因嚴格控制的過程。這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等[22-23]。Bcl-2通過阻止線粒體細胞色素C的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用。此外， Bcl-2具有保護細胞的功能，Bcl-2的過度表達可引起細胞核谷胱苷肽的積聚，導(dǎo)致核內(nèi)氧化還原平衡的改變，從而降低了Caspase的活性。Bax是Bcl-2家族中參與細胞凋亡的一個成員，當誘導(dǎo)凋亡時，它從胞液遷移到線粒體和核膜。細胞內(nèi)的Bax與Bcl-2比值決定線粒體外膜孔道形成，細胞色素C從線粒體釋放，在dATP存在的條件下能與凋亡相關(guān)因子1結(jié)合，使其形成多聚體，并促使caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其他的caspase，如caspase-3等，從而誘導(dǎo)細胞凋亡[24]。caspase-3即半胱天冬蛋白酶-3是凋亡中的關(guān)鍵執(zhí)行者。JS-K可增加Bax蛋白表達而降低Bcl-2蛋白表達，并促使caspase-3的活化形式即剪切的caspase-3表達增加。

因此，JS-K對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用與其誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡有關(guān)。JS-K具有良好的抗腫瘤作用，可能成為一個理想的抗腫瘤候選藥。

[1]El-Sehemy A,Postovit LM,Fu Y.Nitric oxide signaling in human ovarian cancer: a potential therapeutic target[J].Nitric Oxide,2016,15(54):30-37.

[2] Forstermann U,Sessa WC.Nitric oxide synthases: regulation and function[J].Eur Heart J,2012,33(7):829-837.

[3] Rabender CS,Alam A,Sundaresan G,et al.The role of nitric oxide synthase uncoupling in tumor progression [J].Mol Cancer Res,2015,13(6):1034-1043.

[4] Carradori S,Mollica A,De Monte C,et al.Nitric oxide donors and selective carbonic anhydrase inhibitors:a dual pharmacological approach for the treatment of glaucoma,cancer and osteoporosis[J].Molecules,2015,20(4):5667-5679.

[5]Huerta S,Chilka S,Bonavida B.Nitric oxide donors: novel cancer therapeutics (review) [J].Int J Oncol,2008,33(5):909-927.

[6] Hickok JR,Thomas DD.Nitric oxide and cancer therapy: the emperor has NO clothes [J].Curr Pharm Des,2010,16(4):381-391.

[7] Basudhar D,Cheng RC,Bharadwaj G,et al.Chemotherapeutic potential of diazeniumdiolate-based aspirin prodrugs in breast cancer[J].Free Radic Biol Med,2015,83:101-114.

[8] Kogias E,Osterberg N,Baumer B,et al.Growth-inhibitory and chemosensitizing effects of the glutathione-S-transferase-π-activated nitric oxide donor PABA/NO in malignant gliomas[J]. Int J Cancer,2012,130(5):1184-1194.

[9] Townsend DM,Findlay VJ,Fazilev FA.glutathione S-transferase pi-activated prodrug causes kinase activation concurrent with S-glutathionylation of proteins[J].Mol Pharmacol,2006,69(2):501-508.

[10]Qiu M,Chen L,Tan G,et al.A reactive oxygen species activation mechanism contributes to JS-K-induced apoptosis in human bladder cancer cells[J].Sci Rep,2015,5:151-156.

[11]Qiu M,Chen L,Tan G,et al.JS-K promotes apoptosis by inducing ROS production in human prostate cancer cells[J].Oncol Lett,2017,13(3):1137-1142.

[12]Liu L,Wang D,Wang J,et al.The nitric oxide prodrug JS-K induces Ca (2+)-mediated apoptosis in human hepatocellular carcinoma HepG2 Cells[J].J Biochem Mol Toxicol,2016,30(4):192-199.

[13]張奕華,彭司勛.一氧化氮供體型創(chuàng)新藥物的研究進展[J].中國藥科大學學報,2006,37(5):387-396.

[14]Huang Z,Fu J,Liu L,et al.Glycosylated diazeniumdiolate-based oleanolic acid derivatives:synthesis,in vitro and in vivo biological evaluation as anti-human hepatocellular carcinoma agents[J].Org Biomol Chem,2012,10(19):3882-3891.

[15]Fu J,Liu L,Huang Z,et al.Hybrid molecule from O2-(2,4-dinitrophenyl)diazeniumdiolate and oleanolic acid: a glutathione S-transferase π-activated nitric oxide prodrug with selective anti-human hepatocellular carcinoma activity and improved stability[J].J Med Chem,2013,56(11):4641-4655.

[16]Udupi V,Yu M,Malaviya S,et al.JS-K,a nitric oxide prodrug, induces cytochrome c release and caspase activation in HL-60 myeloid leukemia cells[J].Leuk Res,2006,30(10):1279-1283.

[17]Günzle J,Osterberg N,Saavedra JE,et al.Nitric oxide released from JS-K induces cell death by mitotic catastrophe as part of necrosis in glioblastoma multiforme[J].Cell Death Dis,2016,7(9):e2349.

[18]Kaczmarek MZ,Holland RJ,Lavanier SA, et al.Mechanism of action for the cytotoxic effects of the nitric oxide prodrug JS-K in murine erythroleukemia cells[J].Leuk Res,2014,38(3):377-382.

[19]Shami PJ,Saavedra JE,Bonifant CL,et al.Antitumor activity of JS-K [O2-(2,4-dinitrophenyl)1-[(4-ethoxycarbonyl)piperazin-1-yl]diazen-1-ium-1,2-diolate]and related O2-aryl diazeniumdiolates in vitro and in vivo[J].J Med Chem,2006,49(14):4356-4366.

[20]Shami PJ,Saavedra JE,Wang LY,et al.JS-K,a glutathione/glutathione S-transferase-activated nitric oxide donor of the diazeniumdiolate class with potent antineoplastic activity[J].Mol Cancer Ther,2003,2(4):409-417.

[21]Ren Z,Kar S,Wang Z,et al.JS-K,a novel non-ionic diazeniumdiolate derivative, inhibits Hep 3B hepatoma cell growth and induces c-Jun phosphorylation via multiple MAP kinase pathways[J].J Cell Physiol,2003,197(3):426-434.

[22]Cui Q,Wen S,Huang P.Targeting cancer cell mitochondria as a therapeutic approach: recent updates[J].Future Med Chem,2017,9(9):929-949.

[23]Dillon CP,Green DR.Molecular cell biology of apoptosis and necroptosis in cancer[J].Adv Exp Med Biol,2016,930:1-23.

[24]Luna-Vargas MP,Chipuk JE.Physiological and pharmacological control of BAK,BAX,and beyond[J]. Trends Cell Biol,2016,26(12):906-917.