李 揚，蘇軍華，楊麗娟，魏宏蓮

(1.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院醫(yī)務處，河北 石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050000；3.河北醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學教研室，河北 石家莊 050017)

白藜蘆醇對人食管癌EC9706細胞生物學行為的影響及其作用機制

李 揚1，蘇軍華2，楊麗娟3，魏宏蓮2

(1.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院醫(yī)務處，河北 石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050000；3.河北醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學教研室，河北 石家莊 050017)

目的探索白藜蘆醇對人食管癌EC9706細胞生物學行為的影響及其作用機制，為白藜蘆醇用于防治食管癌提供理論依據(jù)。方法不同濃度白藜蘆醇處理食管癌EC9706細胞并作用不同時間，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學改變；電鏡下觀察細胞內(nèi)微形態(tài)改變；四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法測定細胞增殖水平；流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布和細胞凋亡相關(guān)蛋白表達。結(jié)果白藜蘆醇處理使EC9706細胞胞漿內(nèi)顆粒增粗增多，胞質(zhì)減少，細胞變圓變小，形態(tài)呈多樣性；核染色質(zhì)電子密度增加,濃縮并聚集于核膜，部分細胞膜向外層呈銳角突起，細胞質(zhì)內(nèi)有空泡化變性；白藜蘆醇抑制EC9706細胞增殖，并具有量效和時效關(guān)系；白藜蘆醇處理使EC9706細胞G0/G1期前出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰，凋亡率增加，G0/G1期比例增高，而S期和G2/M期比例減少(P<0.01)；4、白藜蘆醇處理使EC9706細胞bcl-2蛋白表達降低，bax蛋白表達升高(P<0.01)。結(jié)論白藜蘆醇可抑制人食管癌EC9706細胞增殖并誘導其凋亡，使細胞周期阻滯在G0/G1期；這種作用可能與其影響凋亡基因bcl-2和bax有關(guān)。

食管腫瘤；白藜蘆醇；細胞增殖；細胞凋亡

食管癌是全球癌癥死亡的第六大原因，在中國發(fā)病率也很高。近年來，盡管在手術(shù)、放療、化療治療食管癌方面有了突飛猛進的發(fā)展，但患者的預后仍然不佳，5年存活率估計只有15%，2年存活率為20%～30%[1]。尤其是化療藥物常存在不良發(fā)應，患者不易耐受。因此，從天然生物中尋找低毒高效的抗腫瘤藥物已成為近年的研究熱點。Jang等[2]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對癌癥各階段具有抑制作用，這使白藜蘆醇成為癌癥領(lǐng)域研究的熱點之一。目前認為白藜蘆醇具有多種生物活性，主要包括抗炎抗氧化活性、免疫調(diào)節(jié)、生長抑制活性、雌激素樣活性等抗腫瘤作用。但其對食管癌是否具有防治作用尚未明確。本研究采用人食管癌細胞株EC9706細胞作為研究對象，檢測白藜蘆醇對其增殖、凋亡和細胞周期的影響，并初步探討作用機制，旨在為白藜蘆醇用于食管癌防治提供實驗依據(jù)，報告如下。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 選取由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院科研中心提供的人食管癌EC9706細胞株；白藜蘆醇、碘化丙啶購于美國Sigma公司；FITC標記的羊抗鼠二抗單克隆抗體、鼠抗人bcl-2蛋白、鼠抗人bax蛋白單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司；MTT、RPMI 1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶、二甲基亞砜購自美國Promega公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；余試劑純由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院科研中心提供。

1.2 主要儀器 普通光學顯微鏡、倒置相差顯微鏡(LH50A型)購自日本OLYMPUS公司；透射電子顯微鏡(H-7500)購自日本日立公司；CO2培養(yǎng)箱(TC 2323型)購自美國SHELDON公司；流式細胞儀(ACS420型)購自美國B.D公司；全自動定量酶標儀購自奧地利Anthos公司；超凈工作臺購自蘇州蘇凈集團安泰公司；高速離心機(SCR20B型)購自日本HITACHI公司；全自動高壓蒸汽消毒器(MLS-3750型)購自日本三洋公司；-80 ℃超低溫冰柜(Universal)購于德國Hettich公司。

1.3 細胞培養(yǎng) 細胞復蘇后接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(鏈霉素 100 mg/L，青霉素 1×105U/L)的細胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換培養(yǎng)液，約3 d傳代1次，最后選取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.4 倒置相差顯微鏡觀察EC9706細胞形態(tài) 細胞接種在放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板上，并于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞生長至對數(shù)期后，分別加入含或不含有白藜蘆醇的新鮮培養(yǎng)液，使白藜蘆醇終濃度分別為0、100、500、1 000、2 000 mmol/L，置于CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，于24、48、72 h時定時觀察細胞的形態(tài)學變化，分別記錄各不同濃度及不同時間的細胞生長抑制率。

1.5 透射電子顯微鏡觀察EC9706細胞微形態(tài) 加入終濃度分別為0、500 mmol/L的白藜蘆醇培養(yǎng)液于對數(shù)生長期的EC9706細胞培養(yǎng)液中，使細胞分散良好，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，然后收集細胞，固定(2.5%戊二醛)，后固定(10 g/L鋨酸)，脫水(丙酮系列)，包埋(Epon821環(huán)氧樹脂)，切片(KB-1型超薄切片機)，雙重染色(醋酸鈾與檸檬酸鉛)，然后在透射電子顯微鏡下觀察細胞微形態(tài)變化。

1.6 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色(methylthiazoliltetracolium colorimetric enzyme reactions trace， MTT)法試驗 選取對數(shù)生長期細胞，制成細胞懸液(濃度為1×106/mL)，然后分5組將細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設12個復孔，每孔200 μL，細胞培養(yǎng)24 h后，細胞貼壁，吸去培養(yǎng)液，隨機選4組分別加入含白藜蘆醇 100、500、1 000、2 000 mmol/L的培養(yǎng)液，剩余1組為對照組，含白藜蘆醇0 mmol/L，分別培養(yǎng)24、48、72 h。并在培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入20 μL，濃度為5 g/L的 MTT，培養(yǎng)結(jié)束后，棄上清，然后在每孔加入150 μL 二甲基亞砜，避光振蕩 15 min。自動酶標儀波長 492 nm檢測各孔光密度值(optical density,OD 值)。結(jié)果判定：抑制率(%)=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況 白藜蘆醇終濃度分別為0、500和1 000 mmol/L，調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，將細胞轉(zhuǎn)移至一次性離心管內(nèi)，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用冰塊上預冷的無菌PBS漂洗2次， 離心(1 500 r/min，5 min)，分散細胞(70%預冷的乙醇)，固定過夜(4 ℃)。過夜后的細胞，離心(1 500 r/min，10 min)，用PBS 漂洗1次，再以生理鹽水洗滌2次， 離心(1 500 r/min，5 min)，以碘化丙錠染液(PI：50 mg/L，Triton X-100：1.0%，RNase A：10 mg/L)，在4 ℃環(huán)境下避光染色30 min，染色完成后過濾。用 488 nm 激發(fā)光在流式細胞儀上檢測細胞 DNA 的含量，并對各樣品進行分析，計算細胞凋亡率(MuticycleAV 軟件)。

1.8 流式細胞術(shù)測定白藜蘆醇對凋亡相關(guān)蛋白bcl-2和bax含量的影響 分別收集白藜蘆醇終濃度為0、500和1 000 mmol/L的細胞懸液，PBS洗滌2次， 離心(1 500 r/min，5 min)，分散細胞(70%預冷的乙醇)，固定過夜(4 ℃)。過夜后的細胞，離心(1 500 r/min，10 min)，用PBS 漂洗1次，再以生理鹽水洗滌2次， 離心(1 500 r/min，5min)，分別加入的bax鼠抗人單克隆抗體和0.1 mL的bcl-2，室溫孵育 30 min，PBS 洗滌1次，加入0.1 mL羊抗鼠 FITC-IgG二抗，室溫孵育 30 min(避光)，然后以PBS洗滌未結(jié)合的多余熒光抗體，加入0.1 mL PBS，過濾(500目銅網(wǎng))，然后用488 nm激發(fā)光在流式細胞儀上檢測，并且設有陰性對照及一抗或二抗的本底對照。最后使用Expo 32ADC 軟件進行數(shù)據(jù)分析，以熒光指數(shù)表示蛋白定量表達。計算公式為：熒光指數(shù)=樣品蛋白表達的平均熒光強度/正常對照樣品平均熒光強度。

1.9 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 倒置顯微鏡下觀察EC9706細胞的形態(tài)學變化 不同濃度白藜蘆醇作用于EC9706細胞24 h后即可見少量細胞變圓，48 h后可見細胞之間距離增大，胞漿內(nèi)顆粒增多增粗，72 h后越來越多的細胞變圓，部分細胞脫落然后懸浮于培養(yǎng)基中，在少數(shù)貼壁生長的細胞中可見細胞膜破裂，并呈細胞壞死狀。

2.2 透射電鏡下觀察EC9706細胞的微形態(tài)學變化 白藜蘆醇 500 mmol/L作用于EC9706細胞72 h后，部分細胞膜向外層呈銳角突起，細胞質(zhì)內(nèi)有空泡化變性，可見核染色質(zhì)濃縮邊集于核膜，電子密度增加(圖1)。

圖1 EC9706細胞的微形態(tài)學變化

A.細胞質(zhì)內(nèi)有空泡化變性;B.核染色質(zhì)濃縮邊集于核膜

Figure 1 The micro morphological changes of EC9706 cells

2.3 白藜蘆醇抑制EC9706細胞增殖 在EC9706細胞增殖過程中，不同濃度的白藜蘆醇均可產(chǎn)生抑制作用，表現(xiàn)出劑量-效應關(guān)系和時間-效應關(guān)系，即隨著白藜蘆醇濃度的增加，細胞增殖的抑制率逐漸增加(P<0.05)，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞增殖的抑制率也逐漸增加(P<0.05)，見表1。

白藜蘆醇濃度(mmol/L)抑制率24h48h72hFP100 7．35±2．119．79±2．0912．85±2．18☆▲7．2820．002500 18．45±2．0527．85±2．05?☆32．72±2．19?☆▲28．2240．000100038．88±3．05?#41．60±3．13?#53．66±3．05?#☆▲28．3910．000200054．66±4．16?#△68．34±4．25?#△☆80．55±4．22?#△☆▲49．3260．000F86．728130．722170．824P0．0000．0000．000

*P<0.05與100 mmol/L組比較 #P<0.05與500 mmol/L組比較 △P<0.05與1 000 mmol/L組比較 ☆P<0.05與24 h比較

▲P<0.05,與48 h比較(SNK-q檢驗)

2.4 白藜蘆醇對EC9706細胞凋亡和細胞周期及細胞凋亡相關(guān)蛋白bcl-2和bax表達的影響 白藜蘆醇500、1 000 mmol/L作用于EC9706細胞72 h后，隨著各組白藜蘆醇濃度增加，在細胞周期中G0/G1期的比例逐漸增加，S期和G2/M期的比例逐漸減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);隨著各組白藜蘆醇濃度增加，凋亡率和bax的熒光指數(shù)逐漸增加，bcl-2的熒光指數(shù)逐漸下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2，圖2。

白藜蘆醇濃度(mmol/L)細胞周期(%)G0/G1SG2/M凋亡率(%)熒光指數(shù)baxbcl?20 42．0±1．2346．3±0．4811．8±0．201．31±1．031．00±0．01100±12 500 59．5±1．28?38．3±0．18?9．3±0．33?10．54±1．422．37±1．0675±16?100068．5±1．69?#22．6±0．27?#8．8±0．05?19．85±1．68?#5．54±3．84#69±18?F 114．613320．03613．15727．3089．96351．322P 0．0000．0000．0000．0000．0470．000

*P<0.05與0 mmol/L組比較 #P<0.05與500 mmol/L組比較(SNK-q檢驗)

圖2 流式細胞術(shù)檢測EC9706細胞凋亡率結(jié)果

A.對照組細胞；B.500 mmol/L白藜蘆醇作用于EC9706細胞；C.1 000 mmol/L白藜蘆醇作用于EC9706細胞

Figure 2 Apoptotic rate of EC9706 cells detected by flow cytometry

3 討 論

芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚類化合物，有順、反2種構(gòu)型，其中反式是穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，因首先在歐洲白藜中被提取出來而得名[3]?，F(xiàn)階段約在21科31屬的72種植物中發(fā)現(xiàn)了白藜蘆,白藜蘆醇化學名稱為芪三酚，分子式為 C14H12O3，化學結(jié)構(gòu)為 3,5,4′-三羥基二苯乙烯(3,5,4′-trihydroxy-stilbene) ，相對分子質(zhì)量是228.2。首次從毛葉藜蘆的根部提取得到一種含有醇，其中以虎杖、葡萄、花生中含量最高。白藜蘆醇具有抗腫瘤活性，抗自由基、保護心血管、抗炎、抗激素活性、抗病毒、抗菌等方面多種生物活性作用。

食管癌預后較差，多數(shù)患者在確診后1～2年內(nèi)死亡， 20%的患者能生存 5 年以上[4]。雖然近年來其治愈率有了很大提高，但總有相當患者在就診時或治療過程中發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，最終導致治療失敗。河北省是食管癌的高發(fā)區(qū)，尤以邯鄲的涉縣高發(fā)。目前在無更有效治療手段條件下，預防是減少其發(fā)生率的有力手段。尋求一種高效低毒的抗腫瘤藥物是治療食管癌的當務之急。白藜蘆醇作為一種植物提取素具有天然低毒的特性。國內(nèi)外研究證實其作為腫瘤抑制劑在多種腫瘤中均具有高效性，包括肝癌、胃癌、血液病、前列腺癌、子宮癌、乳腺癌等[5-10]。但是，目前對白藜蘆醇在食管癌的抗腫瘤中作用的研究尚少。本研究旨在進一步證實白藜蘆醇在抗食管腫瘤中同樣具有一定的作用，以便為白藜蘆醇今后應用于食管癌的治療提供相關(guān)實驗證據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇對EC9706細胞的作用呈時間-劑量依賴，但是在低濃度(100 mmol/L)時，細胞生長抑制率差別不大；在白藜蘆醇同一濃度下，隨著作用時間的延長白藜蘆醇對EC9706細胞的抑制作用增強，大于72 h高濃度白藜蘆醇作用下EC9706細胞懸浮于培養(yǎng)瓶中，無貼壁生長(細胞死亡)。以上證明了白藜蘆醇在一定作用時間和一定濃度范圍內(nèi)，對食管癌細胞生長增殖具有抑制作用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，許多抗腫瘤藥物的作用除抑制腫瘤細胞生長外，還可誘導其凋亡[11-12]。本研究應用流式細胞儀檢測細胞凋亡，輔以透射電鏡微觀觀察不同濃度白藜蘆醇作用于EC9706細胞后，細胞的凋亡情況，結(jié)果顯示對照組未發(fā)現(xiàn)凋亡的細胞，而白藜蘆醇500、1 000 mmol/L組細胞凋亡明顯；在DNA直方圖中，也可以觀察到較為明顯的亞二倍體凋亡峰，細胞周期阻滯在G0/G1期；透射電鏡鏡下觀察，白藜蘆醇500 mmol/L組可見凋亡細胞特征，而對照組細胞生長良好。表明白藜蘆醇可提高食管癌EC9706細胞凋亡率，使EC9706細胞的細胞周期阻滯在G0/G1期。因此，白藜蘆醇抗食管腫瘤的主要機制可能是白藜蘆醇能夠誘導食管癌EC9706細胞凋亡。

Bcl-2是一種跨膜蛋白，存在于線粒體外膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上[13]。雖然bcl-2基因曾被認為是一種原癌基因，但隨后的大量實驗結(jié)果卻表明該基因本身對細胞增殖沒有影響，也不能促使細胞惡性轉(zhuǎn)化。bax相對分子質(zhì)量約為21 000，bax基因長約4.5 kb，bax是bcl-2的抑制因子，其與bcl-2具有21%的同源性[14]。bax和bcl-2在細胞凋亡的過程中發(fā)揮的作用相反，二者的比例發(fā)生變化，可以誘導凋亡的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，bcl-2和bax在前列腺癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤細胞的細胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，并且與食管癌細胞凋亡密切相關(guān)[15-20]。本研究應用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)bcl-2和bax的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以明顯上調(diào)bax的表達及下調(diào)bcl-2的表達，這可能是白藜蘆醇誘導EC9706細胞凋亡的分子機制之一。

綜上所述，白藜蘆醇能夠抑制EC9706細胞增殖并誘導其凋亡，使其細胞周期阻滯在G0/G1期；白藜蘆醇可能通過影響凋亡基因bcl-2和bax，從而抑制細胞的增殖，并促進其凋亡。因此，白藜蘆醇可能成為防治食管癌的有效藥物之一用于臨床治療食管癌。

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(本文編輯：許卓文)

Effects of resveratrol on biological behavior of human esophageal cancer cell EC9706 and its mechanism

LI Yang1, SU Jun-hua2, YANG Li-juan3, WEI Hong-lian2

(1.Department of Medical Service, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China; 2.Department of Laboratory, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China; 3.Department of Immunology, School of Basic Medical, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China)

Objective To explore the effects of resveratrol on biological behavior of human esophageal cancer cell EC9706 and its mechanism, and to provide a theoretical basis for the clinical application of resveratrol to prevent or treat esophageal cancer. Methods Different concentrations of resveratrol were used to treat EC9706 cells for different time. Cell morphology was observed by inverted phase contrast microscope. Intracellular micro-morphological changes were observed under electron microscope. Methylthiazoliltetracolium colorimetric enzyme reactions trace method were used to determinate cell proliferation level. Flow cytometry method was used to detect cell cycle distribution and the expression of apoptosis related protein. Results Resveratrol treatment increased and thickened particles in EC9706 cytoplasm, reduced the cytoplasm, rounded cells and made cells more smaller and the cell shape more diversity, and made the nuclear chromatin condense on the boundary of the nuclear envelope. The electron density was increased, part of the cell membrane bulge was outward and form an acute angle. There was vacuoles degeneration in the cytoplasm. Resveratrol inhibited EC9706 cell proliferation in a dose and time-dependent manner. Resveratrol made sub-diploid nuclear peak(apoptotic peak) appear before G0/G1phase in EC9706 cells, and increased the rate of apoptosis together with proportion of G0/G1phase. In contrast, resveratrol decreased the S and G2/M phase fraction(compared with the control group,P<0.01). Resveratrol treatment also decreased expression of bcl-2 protein, and increased expression of bax protein(compared with the control group,P<0.01). Conclusion Resveratrol can inhibit the proliferation and induces apoptosis of EC9706 cells, and make the cell cycle arrest in G0/G1phase. This effect may be related to apoptosis gene bcl-2 and bax.

esophageal neoplasms; resveratrol; cell proliferation; apoptosis

2016-04-01；

2016-10-25

李揚(1977-)，男，河北衡水人，河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院主管檢驗師，醫(yī)學碩士，從事臨床檢驗學研究。

R735.1

A

1007-3205(2017)01-0011-06

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.01.003