李青梅，王 麗，馮麗麗，張雨杭，趙 東，楊艷艷，邢廣旭，柴書(shū)軍，李賽賽，張麗萍，郭軍慶*，張改平，，4*

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，河南鄭州450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450002；4.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州225009）

雞新城疫病毒中和單克隆抗體的制備及鑒定

李青梅1，王 麗1，馮麗麗2，張雨杭3，趙 東1，楊艷艷1，邢廣旭1，柴書(shū)軍1，李賽賽1，張麗萍1，郭軍慶1*，張改平1，3，4*

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，河南鄭州450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450002；4.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州225009）

采用差速離心法純化雞新城疫病毒（NDV）標(biāo)準(zhǔn)毒株F48E8，免疫Balb/c小鼠，應(yīng)用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備抗NDV單克隆抗體，旨在為NDV中和抗原表位分析奠定基礎(chǔ)。將NDV感染BHK-21細(xì)胞，建立異源免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)（IPMA）的單克隆抗體檢測(cè)方法，篩選獲得14株分泌抗NDV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其單克隆抗體腹水IPMA效價(jià)均在0.50×10-2～2.56×10-5（F48E8株和LaSota株）。血凝抑制試驗(yàn)（HI）結(jié)果表明，單克隆抗體1G6、2C1、4D2、5F2和13A5具有血凝抑制活性，其HI效價(jià)在（6～12）log2（F48E8株）和（9～11）log2（LaSota株）。病毒中和試驗(yàn)結(jié)果表明，單克隆抗體5F2和13A 5對(duì)F48E8株和LaSota株均有明顯的病毒中和活性，中和效價(jià)分別為1∶400～1∶800和1∶25。夾心ELISA結(jié)果表明，單克隆抗體5F2識(shí)別NDV HN蛋白，13A5識(shí)別F蛋白。綜上，成功制備了具有中和活性的NDV單克隆抗體（5F2和13A5）。

雞新城疫病毒；單克隆抗體；免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)；血凝抑制試驗(yàn)；中和試驗(yàn)；中和活性

雞新城疫（Newcastle disease，ND）又稱(chēng)亞洲雞瘟，是由雞新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一種以呼吸道、消化道黏膜出血為典型病變的高度接觸性、急性敗血性禽類(lèi)傳染病，世界衛(wèi)生組織（OIE）將其列為應(yīng)呈報(bào)疫病，我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物傳染?。?-2］。我國(guó)采用弱毒疫苗預(yù)防控制了ND的大規(guī)模流行，但ND的流行和發(fā)病特點(diǎn)又發(fā)生新變化，多表現(xiàn)為非典型和慢性感染，出現(xiàn)了所謂“非典型新城疫”和“溫和型新城疫”，同時(shí)NDV與禽流感病毒等其他呼吸道病原混合感染也十分普遍，使得ND的臨床診斷和防制更加困難。

NDV為有囊膜、不分節(jié)段、單股負(fù)鏈RNA病毒，屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）副黏病毒亞科（Paramyxovirinae）禽腮腺炎病毒屬（Avulaviruss），其血清型為禽副黏病毒1型（APMV-1）［1］。NDV基因組長(zhǎng)度為15 186、15 192或15 198個(gè)核苷酸（nt），含有6個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），依次編碼核衣殼蛋白（Nucleocapsid，N）、磷蛋白（Phosphoprotein，P）、基質(zhì)蛋白（Matrix，M）、融合蛋白（Fusion，F(xiàn)）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（Heamagglutinin-Neuram inidase，HN）和大RNA依賴(lài)RNA聚合酶（Large RNA dependent RNA-polymerase，L）6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，其中F和HN蛋白是NDV表面重要的2個(gè)囊膜糖蛋白，為病毒的中和抗原，負(fù)責(zé)病毒吸附和細(xì)胞膜融合，在病毒感染過(guò)程中起到重要的作用［3］。NDV根據(jù)其基因組長(zhǎng)度和F基因序列分為ClassⅠ和ClassⅡ2大系譜，后者包含大多數(shù)強(qiáng)毒株和弱毒株，主要分布于家禽和野鳥(niǎo)，根據(jù)F基因序列又分為10個(gè)基因型（Ⅰ—Ⅹ）：基因Ⅰ型NDV除1998—2000年澳大利亞強(qiáng)毒株外，其余均為弱毒株；基因Ⅱ型NDV除廣泛用于活疫苗的弱毒株（如LaSota株等），還有中等毒力毒株和高致病力的強(qiáng)毒株；而Ⅲ—Ⅹ型NDV均為強(qiáng)毒株［4］。流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，20世紀(jì)90年代中期，我國(guó)出現(xiàn)了NDV基因Ⅶ型，并且其成為我國(guó)NDV流行的優(yōu)勢(shì)基因型，當(dāng)前Ⅶd亞型在我國(guó)流行強(qiáng)毒株中已占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)［2，5］。在NDV單克隆抗體方面，Panshin等［6-7］利用抗NDV HN、F、M、N蛋白等系列單克隆抗體對(duì)NDV分離毒株的抗原表位進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，分離毒株的病毒蛋白與疫苗株均存在抗原差異，而M蛋白的抗原表位差異最顯著。Hu等［8］利用5株具血凝抑制（HI）活性單克隆抗體對(duì)15株NDV強(qiáng)毒株進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，HN蛋白347位氨基酸殘基的E/G→K的突變導(dǎo)致抗原表位（345—353位）缺失。然而，目前對(duì)NDV抗原表位特別是中和抗原表位特征及其變異規(guī)律尚缺乏系統(tǒng)分析。

本研究利用NDV感染BHK-21細(xì)胞建立異源免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)（IPMA）單克隆抗體檢測(cè)方法，篩選具有中和活性的NDV單克隆抗體，以期為NDV中和抗原表位分析奠定基礎(chǔ)，為NDV新型疫苗的分子設(shè)計(jì)和免疫評(píng)價(jià)提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 毒株與細(xì)胞

雞新城疫病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株F48E8和疫苗毒株Lasota均購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所，分離毒株G1、G2、ND1、ND6、ND7、XX-08由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定；小鼠漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系NS0由英國(guó)國(guó)家動(dòng)物健康研究院惠贈(zèng)，以含10%胎牛血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，用于細(xì)胞融合；乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞BHK-21由本實(shí)驗(yàn)室保存，以含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，用于NDV感染試驗(yàn)。

1.2 供試動(dòng)物

SPF級(jí)Balb/c小鼠購(gòu)自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在SPF級(jí)IVC籠中飼養(yǎng)，用于動(dòng)物免疫；SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，用孵化器孵育至9～10日齡，用于NDV增殖。

1.3 抗原制備

以9～10日齡SPF雞胚培養(yǎng)NDV標(biāo)準(zhǔn)毒株F48E8與疫苗毒株Lasota，收集尿囊液，以差速離心純化培養(yǎng)病毒。取尿囊液200 m L，4℃、3 000 r/min離心30 min，取上清；凍融3次后，4℃、8 000 r/min離心15 min，取上清；4℃、60 000 r/min離心60 min，棄上清；以5 m L PBS緩沖液（pH值7.2）充分重懸沉淀，測(cè)量蛋白質(zhì)含量和血凝（HA）效價(jià)。

1.4 動(dòng)物免疫

選取5只6周齡Balb/c小鼠，免疫劑量為100 μg/只。首次免疫以等量弗氏完全佐劑乳化抗原，皮下多點(diǎn)注射，每只100μL；加強(qiáng)免疫以弗氏不完全佐劑乳化抗原，每次間隔21 d加強(qiáng)免疫1次，第3、4次免疫后20 d斷尾分離血清，以HI試驗(yàn)測(cè)定血清效價(jià)；超強(qiáng)免疫在融合前3～5 d小鼠腹腔注射50μg NDV抗原。

1.5 細(xì)胞融合

取超強(qiáng)免疫后4 d的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合，無(wú)菌手術(shù)取出脾臟，研磨分離成單個(gè)脾細(xì)胞，與NS0細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行融合［9］。用HAT培養(yǎng)基對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，第10～12天取細(xì)胞上清進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，選擇強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞孔以有限稀釋法進(jìn)行克隆，建立穩(wěn)定分泌抗NDV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

1.6 單克隆抗體制備

以體內(nèi)誘生腹水法制備抗NDV單克隆抗體，將（2～5）×106個(gè)細(xì)胞腹腔注射經(jīng)液體石蠟致敏的8周齡Balb/c小鼠，10～15 d后抽取小鼠腹水，分別以H I試驗(yàn)、IPMA試驗(yàn)和夾心ELISA法測(cè)定腹水的抗體效價(jià)。

1.7 HA與H I試驗(yàn)

在96孔“V”型微量反應(yīng)板倍比稀釋NDV尿囊液，50μL/孔，每孔加入等量0.5%雞紅細(xì)胞，室溫靜置30 min，觀察紅細(xì)胞凝集，以100%凝集的最大稀釋度為尿囊液HA效價(jià)。在微量反應(yīng)板加4×HA單位NDV尿囊液（第1列8×HA單位），50μL/孔；在第1列加入待檢等量腹水，并進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)詈?列設(shè)PBS對(duì)照，室溫作用30 min；每孔加入等量0.5%雞紅細(xì)胞，室溫靜置30 min，觀察紅細(xì)胞凝集，以100%抑制凝集的最大稀釋度為腹水HI效價(jià)。

1.8 IPM A試驗(yàn)

利用NDV F48E8株和LaSota株感染BHK-21細(xì)胞，建立NDV單克隆抗體的異源IPMA檢測(cè)方法。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞至80%，分別接種NDV毒株，感染12 h后，棄去培養(yǎng)上清，每孔加入含0.1%H2O2的甲醇溶液，室溫固定15 min；5%脫脂奶37℃封閉1 h；將待檢雜交瘤細(xì)胞上清或梯度稀釋腹水分別加入NDV感染孔中，37℃反應(yīng)30 m in；每孔加入羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37℃反應(yīng)30 min；上述每步均以含0.05%Tween-20的PBS充分洗滌；加入AEC顯色液室溫顯色10～15 min，在顯微鏡下觀察顯色。

1.9 病毒中和試驗(yàn)

應(yīng)用Reed-Muench方法測(cè)定NDV F48E8株和LaSota株對(duì)BHK-21的半數(shù)細(xì)胞感染量（TCID50）。將不同稀釋度的單克隆抗體腹水與100 TCID50NDV混合，37℃反應(yīng)30 min，然后感染BHK-21細(xì)胞，感染24 h后，利用雞NDV陽(yáng)性血清以IPMA法檢測(cè)NDV的感染，以100%抑制NDV感染的稀釋度為腹水中和效價(jià)。

1.10 夾心ELISA試驗(yàn)

用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH值9.6）1∶200稀釋NDV IgG，包被96孔酶標(biāo)板，50μL/孔，4℃過(guò)夜；經(jīng)5%脫脂奶37℃封閉1 h后，加入適當(dāng)稀釋的HN和F轉(zhuǎn)基因水稻重組蛋白，37℃反應(yīng)30 min；每孔加入待檢雜交瘤細(xì)胞上清或梯度稀釋腹水，50μL/孔，37℃反應(yīng)30 min；每孔加入羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37℃反應(yīng)30 min；上述每步均以含0.05% Tween-20的PBS充分洗滌；加入TMB顯色液室溫顯色5～10 min，2 mol/L H2SO4終止顯色，酶標(biāo)儀讀取OD450值，計(jì)算待檢抗體S/N值（S/N=ODmAb/ ODPBS），并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NDV培養(yǎng)與純化結(jié)果

用SPF雞胚培養(yǎng)NDV標(biāo)準(zhǔn)毒株F48E8，尿囊液經(jīng)差速離心后，獲得初步純化病毒，其蛋白質(zhì)含量為5.3 mg/m L，HA效價(jià)為12log2。

2.2 抗NDV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞篩選結(jié)果

以NDV F48E8株和LaSota株感染BHK-21細(xì)胞對(duì)NDV雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行異源IPMA檢測(cè)，篩選抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞50余株，經(jīng)連續(xù)3次亞克隆，獲得分泌抗NDV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞14株（1B3、1G6、2A5、2C1、3C2、3D10、4D2、5D6、5D7、5E10、5F2、13A5、15H6、16G2），并制備了相應(yīng)的單克隆抗體腹水，單克隆抗體的IPMA結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3 抗NDV單克隆抗體效價(jià)

分別以IPMA和HI試驗(yàn)測(cè)定抗NDV單克隆抗體腹水的抗體效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表1。14株單克隆抗體對(duì)NDA標(biāo)準(zhǔn)毒株F48E8和疫苗毒株LaSota的IPMA效價(jià)均在0.50×10-2～2.56×10-5；HI試驗(yàn)結(jié)果顯示，單克隆抗體1G6、2C1、4D2、5F2和13A5具有HI活性，其對(duì)NDV標(biāo)準(zhǔn)毒株F48E8和疫苗毒株LaSota的HI效價(jià)分別在（6～12）log2和（9～11）log2。值得注意的是，單克隆抗體2C1在IPMA和HI試驗(yàn)中均識(shí)別強(qiáng)毒株F48E8，但均不識(shí)別疫苗毒株LaSota。

2.4 抗NDV單克隆抗體識(shí)別NDV的反應(yīng)譜

分別以NDV標(biāo)準(zhǔn)毒株、流行毒株和疫苗毒株感染BHK-21細(xì)胞，檢測(cè)抗NDV單克隆抗體識(shí)別NDV的反應(yīng)圖譜，IPMA結(jié)果顯示，除單克隆抗體2C1只識(shí)別NDV標(biāo)準(zhǔn)毒株F48E8外，其他單克隆抗體均識(shí)別NDV標(biāo)準(zhǔn)毒株、流行毒株和疫苗毒株，具有較廣的NDV反應(yīng)譜（表2）。

2.5 抗NDV單克隆抗體中和活性

分別以不同稀釋度抗NDV單克隆抗體腹水處理適當(dāng)稀釋的NDV毒株，然后接種BHK-21細(xì)胞，利用雞NDV陽(yáng)性血清、以IPMA法測(cè)定病毒對(duì)細(xì)胞的感染情況，評(píng)估抗NDV單克隆抗體對(duì)NDV的中和活性，結(jié)果顯示，單克隆抗體5F2和13A5能抑制NDV標(biāo)準(zhǔn)毒株F48E8和疫苗毒株LaSota對(duì)細(xì)胞的感染，具有病毒中和活性。2株單克隆抗體腹水對(duì)F48E8株的中和效價(jià)分別為1∶800和1∶25，對(duì)LaSota株的中和效價(jià)分別為1∶400和1∶25。

2.6 抗NDV單克隆抗體識(shí)別病毒蛋白

分別利用轉(zhuǎn)基因水稻表達(dá)的NDV HN和F重組蛋白以?shī)A心ELISA測(cè)定抗NDV單克隆抗體所識(shí)別的病毒蛋白，根據(jù)待檢抗體的OD450計(jì)算S/N值，并設(shè)定臨界值為2.5。由圖2可知，單克隆抗體1G6、4D2、5D6、5F2、15H6和16G2檢測(cè)HN重組蛋白的S/N值顯著高于F重組蛋白和臨界值，表明其識(shí)別NDV HN蛋白；單克隆抗體1B3、2A 5、2C1、3C2、3D10、5E10和13A5檢測(cè)F重組蛋白的S/N值高于HN重組蛋白和臨界值，表明其識(shí)別NDV F蛋白；單克隆抗體5D7對(duì)HN和F重組蛋白的S/N值低于2.5，提示其可能識(shí)別NDV其他病毒蛋白。值得注意的是，具有病毒中和活性的單克隆抗體5F2和13A5分別識(shí)別HN蛋白和F蛋白。

3 結(jié)論與討論

NDV為囊膜病毒，HN和F蛋白等病毒蛋白鑲嵌在病毒囊膜中，在病毒感染和免疫識(shí)別中發(fā)揮重要作用，也是疫苗設(shè)計(jì)和免疫檢測(cè)的重要靶標(biāo)蛋白。病毒密度梯度離心是病毒純化的常用方法，能夠獲得較高純度的病毒粒子，然而在長(zhǎng)時(shí)間的超速離心過(guò)程中，病毒囊膜容易受損，導(dǎo)致囊膜蛋白脫落和丟失。本試驗(yàn)采用低速和中高速離心去除尿囊液雜質(zhì)后，通過(guò)超速短時(shí)離心純化病毒粒子，既獲得較高純度的病毒，又最大限度降低超速離心對(duì)病毒囊膜的損害，保證純化病毒具有良好感染毒力和血凝活性，為獲得病毒囊膜蛋白單克隆抗體提供基礎(chǔ)保障。

陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選是單克隆抗體生產(chǎn)鑒定的關(guān)鍵。NDV免疫抗原中的雞胚尿囊液成分誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體是單克隆抗體篩選的最大障礙，本試驗(yàn)前期嘗試H I試驗(yàn)、間接ELISA和夾心ELISA等篩選方法，均不能有效區(qū)分針對(duì)病毒與雞胚成分的抗體。鑒于NDV不僅能在雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）增殖，而且可以感染多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞［10］，本試驗(yàn)以NDV感染BHK-21細(xì)胞建立了異源IPMA抗體篩選方法，NDV感染的BHK-21細(xì)胞只能被NDV陽(yáng)性血清或抗體特異識(shí)別，不與其他抗體發(fā)生非特異反應(yīng)，有效屏蔽了抗雞胚成分抗體的干擾，實(shí)現(xiàn)了NDV單克隆抗體的高效篩選，切實(shí)提高了單克隆抗體的生產(chǎn)鑒定效率。

本試驗(yàn)獲得了2株具有病毒中和活性的單克隆抗體5F2和13A5，且對(duì)NDV標(biāo)準(zhǔn)毒株和疫苗毒株均顯示良好中和作用，其中，5F2識(shí)別NDV HN蛋白，而13A5識(shí)別F蛋白，提示上述2株單克隆抗體識(shí)別NDV的中和抗原表位保守性強(qiáng)，對(duì)其識(shí)別抗原表位的分析鑒定，將為NDV新型疫苗和免疫評(píng)價(jià)技術(shù)研究奠定良好基礎(chǔ)。

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Production and Characterization of Neutralizing Monoclonal Antibodies against Newcastle Disease Virus

LIQingmei1，WANG Li1，F(xiàn)ENG Lili2，ZHANG Yuhang3，ZHAO Dong1，YANG Yanyan1，XING Guangxu1，CHAIShujun1，LISaisai1，ZHANG Liping1，GUO Junqing1*，ZHANG Gaiping1，3，4*
（1.Key Laboratory of Animal Immunology，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China；2.Institute of Agricultural Economics and Information，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China；3.College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；4.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，Yangzhou 225009，China）

Balb/c mice were immunized by the Newcastle disease virus（NDV）reference strain F48E8 purified by differential centrifugation，and used formonoclonal antibodies（m Abs）production using hybridoma technology.After screened by a heterologous immunoperoxidase monolayer assay（IPMA）based on the NDV-infected BHK-21 cells，fourteen hybridoma cell lines secreting mAbs specific for NDV were obtained，whose antibody titers of ascites were determ ined to be 0.50×10-2—2.56×10-5to F48E8 and to La-Sotain by IPMA respectively.In hemagglutination inhibition（H I）assay，mAbs 1G6，2C1，4D2，5F2 and 13A5 showed hemagglutination-inhibitory activity with the HI titers of 6—12log2（F48E8）and 9—11 log2（LaSota），of which mAbs 5F2 and 13A5 showed significant neutralizing activity to both NDV virulent and vaccine strains in the virus neutralization（VN）testw ith the titers of 1∶400—1∶800 and 1∶25 respectively.Furthermore，sandwich ELISA using the recombinant proteins showed that mAb 5F2 reacted with HN protein of NDV，whilem Ab 13A5 recognized the F protein.In conclusion，the NDV m Abs of 5F2 and 13A5 with neutralization activity were obtained successfully.

Newcastle disease virus；monoclonal antibodies；immunoperoxidase monolayer assay；hemagglutination inhibition assay；neutralization assay；neutralization activity

S855.3

A

1004-3268（2017）01-0127-05

2016-09-20

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2016YFD0500800）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201303033）；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（162102110051）

李青梅（1972-），女，河南鄭州人，副研究員，主要從事快速檢測(cè)技術(shù)研究。E-mail：350164155@qq.com

*通訊作者：張改平（1960-），男，河南內(nèi)黃人，研究員，博士，主要從事動(dòng)物免疫學(xué)研究。E-mail：zhanggaiping2003@163.com郭軍慶（1970-），男，河南林州人，研究員，博士，主要從事動(dòng)物免疫學(xué)研究。E-mail：13838248132@163.com