程 沖 陳啟鳴

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應(yīng)用M48磁珠試劑盒提取牙齒DNA

程 沖 陳啟鳴

泉州市公安局刑偵支隊(duì)

：應(yīng)用M48磁珠試劑盒提取牙齒DNA，并評(píng)價(jià)其應(yīng)用價(jià)值。：對(duì)實(shí)驗(yàn)室日常受理的6例牙齒，分別采用有關(guān)文獻(xiàn)提出的QIAquick?PCR純化試劑盒方法和M48磁珠試劑盒提取牙齒DNA。：6例牙齒采用兩種方法檢出結(jié)果一致，但是M48磁珠試劑盒提取牙齒DNA過程較簡(jiǎn)單、時(shí)間短。結(jié)論：M48磁珠試劑盒可以應(yīng)用于牙齒DNA提取，并能大大減少實(shí)驗(yàn)人員工作量。

法醫(yī)物證 牙齒 DNA提取

牙齒DNA含量較骨骼少，但是牙齒外層由牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)包裹，能夠抵抗外界環(huán)境的影響破壞，使得DNA不易被降解，而且牙齒易于提取、包裝。因此，在一些白骨化案件中，牙齒的DNA檢驗(yàn)經(jīng)常用于尸源認(rèn)定。筆者采用M48磁珠試劑盒提取牙齒DNA，獲得了較好的結(jié)果，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本

本實(shí)驗(yàn)室日常受理的牙齒6份。

1.2 儀器和試劑

9700型擴(kuò)增儀（AB公司）；3130XL型測(cè)序儀（AB公司）；M48磁珠（Qiagen公司）；Identifiler Plus試劑盒（AB公司）；骨骼孵育液（Promega公司）；EDTA緩沖液（Promega公司）；QIAquick?PCR純化試劑盒（Qiagen公司）。

1.3 方法

1.3.1牙齒DNA的提取

（1）取牙齒1顆用清水洗凈表面，用手術(shù)刀片刮去牙齒表層及污垢物，再用無水乙醇泡洗1次，去除殘余的水份，用濾紙拭干。將牙齒放入砸牙器中用錘子砸成粉末，取100mg左右牙粉置于1.5mL離心管中。

（2）加入300μL骨骼孵育液、500μL EDTA緩沖液和20μL 20mg/mL PK，20μL 1 mol/ LDTT，56℃孵育6h以上。

（3）離心管快速離心后，吸取上清液600μL至15mL 離心管內(nèi)，加入M48磁珠試劑盒MTL 2mL，磁珠30μL。

（4）將15mL離心管放至翻轉(zhuǎn)搖勻儀搖勻15min。

（5）將15mL離心管緊貼磁力架，顛倒2次，確保磁珠吸附在磁力架一側(cè)，小心打開蓋子，倒去吸附液。

（6）15mL離心管加入100μL無水乙醇（消泡）、800μL MW1，振蕩5s，小心將所有液體倒入1.5mL離心管中，磁力架吸棄液體，再用80%乙醇洗滌3次，打開蓋子，65℃干燥5min。

（7）將30μL 純水加入1.5mL離心管，蓋上蓋子，振蕩，65℃孵育10min，13000rpm離心1min，收集上清液4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

另取牙粉100mg按照文獻(xiàn)[1]中QIAquick?PCR純化試劑盒方法提取牙齒DNA，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

采用Identifiler Plus試劑盒在9700型擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為10μL，DNA模板為1μL，擴(kuò)增參數(shù)參照Identifiler Plus試劑盒操作手冊(cè)。取上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3130XL型測(cè)序儀電泳，結(jié)果用GeneMapper ID v3.2軟件進(jìn)行分析，獲得等位基因分型圖譜。

2 結(jié)果

2.1 M48磁珠試劑盒法與文獻(xiàn)[1]中QIAquick? PCR純化試劑盒方法結(jié)果比較

本文中，6例牙齒經(jīng)不同提取方法檢驗(yàn)均全部得出了一致的檢驗(yàn)結(jié)果。兩種方法分別采用Qiagen公司生產(chǎn)的硅膜法、磁珠法提取純化DNA，比較不同提取方法的檢驗(yàn)結(jié)果，M48磁珠試劑盒提取牙齒DNA操作簡(jiǎn)單快捷，純化提取耗時(shí)30min左右，且大部分為磁珠吸附時(shí)間，人工干預(yù)少，較文獻(xiàn)[1]中QIAquick?PCR純化試劑盒方法節(jié)省時(shí)間，且文獻(xiàn)[1]中牙齒提取方法由于牙齒消化后需要純化的體系較大，牙齒消化液與PBI溶液要按體積比1:5混勻，一般混合液能達(dá)到3mL左右，需多次離心才能過濾完全部混合液，而M48磁珠方法只需1次吸附就能轉(zhuǎn)換為1.5mL小離心管，在理論上減少了交叉污染的可能。同時(shí)，經(jīng)檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，兩種方法提取牙齒DNA在峰高、平衡性方面無顯著差異。

2.2 案例檢驗(yàn)應(yīng)用

2016年10月26日，泉州市某水庫發(fā)現(xiàn)一具白骨化尸體，送檢牙齒2顆。牙齒采用本文方法提取DNA，并進(jìn)行STR分型檢驗(yàn)，結(jié)果成功獲得STR分型（圖1），為本案尸源認(rèn)定提供了重要依據(jù)。

圖1 牙齒STR分型

3 討論

M48磁珠試劑盒法提取牙齒DNA的優(yōu)勢(shì)有：（1）檢材需求量少，僅需100mg牙粉即可滿足檢驗(yàn)需求。（2）牙粉無需單獨(dú)脫鈣處理。（3）牙粉消化液利用磁珠吸附原理，操作簡(jiǎn)便，節(jié)約時(shí)間。（4）離心次數(shù)少，減少交叉污染。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種方法檢出率一致，但M48磁珠試劑盒法在操作過程更具有優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，M48磁珠試劑盒提取牙齒DNA操作簡(jiǎn)單，無需特殊儀器，成功率高，提取成本低廉，能滿足實(shí)際檢案的需求。

[1]凃政,劉志芳,陳松,等.牙齒的DNA提取及STR分型研究[J].刑事技術(shù), 2007,196 (5): 9-11.