楊移斌 艾曉輝

水產(chǎn)降解菌篩選一般方法及可能存在的問題

楊移斌 艾曉輝

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，人們生活水平不斷提高，人們對(duì)食品、環(huán)境等安全意識(shí)不斷提高。因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用有益微生物替代化學(xué)藥物的呼聲高漲，同時(shí)也引起了廣大科研及養(yǎng)殖工作者積極回應(yīng)。目前水產(chǎn)中微生態(tài)制劑主要分為三大類：①水質(zhì)改良類。主要用于水質(zhì)調(diào)節(jié)，養(yǎng)殖池底改良，有毒有害物質(zhì)分解，抑制有害藻類或促進(jìn)有益藻類生長等。②病原拮抗類。主要用于抑制水產(chǎn)病原的生長繁殖，預(yù)防病害的暴發(fā)。③促魚類生長及免疫增強(qiáng)類。主要功能是促進(jìn)魚類生長，增強(qiáng)魚類抵抗力，調(diào)節(jié)腸道健康。隨著微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，快速篩選有效安全的益生菌株成為了研究的熱點(diǎn)。本文就常用微生態(tài)制劑中水質(zhì)改良類之一的降解菌篩選方法做一個(gè)探討，并分析本人認(rèn)為可能存在的一些問題，以期與水產(chǎn)同行交流，更好地促進(jìn)降解菌在水產(chǎn)中的應(yīng)用。

1 降解菌篩選一般方法

1.1 富集培養(yǎng)

在錐形瓶中加入100mL蒸餾水，121℃滅菌。無菌條件下取10g可能含有降解菌的樣品于上述培養(yǎng)基中，于30℃、180rpm震蕩培養(yǎng)3天。

1.2 馴化培養(yǎng)

在錐形瓶中加入基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基100mL，121℃滅菌后，加入0.5mL已過濾的目標(biāo)降解物標(biāo)準(zhǔn)液，使目標(biāo)降解物的終濃度為50mg/L。在無菌條件下取土壤培養(yǎng)液的上清液，于30℃、180rpm震蕩培養(yǎng)5天。5天后按10%的接種量取培養(yǎng)液上清液，接入到目標(biāo)降解物濃度為100mg/L新鮮的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，同法培養(yǎng)5天。逐次提高目標(biāo)降解物的濃度，每次提高50mg/ L，使基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中目標(biāo)降解物終濃度為300mg/L。

1.3 分離純化

從最后一次馴化培養(yǎng)液涂布得到的平板挑取單菌落，進(jìn)行劃線純化，得到單菌落后再挑取單菌落進(jìn)行劃線，對(duì)在培養(yǎng)基上生長良好、傳代穩(wěn)定的不同菌株進(jìn)行編號(hào)后，于4℃冰箱保存，以進(jìn)行下一步降解能力的測定。

1.4 菌株降解能力測定

從平板上挑取單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，于30℃、180rpm搖床培養(yǎng)48h，4000rpm離心10min收集菌體，用0.02M磷酸鹽緩沖液洗滌2次，再用相同緩沖液制成菌體懸獨(dú)液作為種子液。以10%的接種量，將種子液接種到含有100mg/L目標(biāo)降解物的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，于30℃、180rpm搖床培養(yǎng)5d，以不接菌的目標(biāo)降解物培養(yǎng)液為空白，每24h取樣測OD600，5d后經(jīng)色譜法測定菌株對(duì)目標(biāo)降解物的降解率。

1.5 菌株的鑒定

對(duì)分離得到的菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行形態(tài)觀察、電鏡觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行16S rDNA基因序列分析。其中生理生化實(shí)驗(yàn)包括：革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、氧化酶實(shí)驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)。

2 存在的問題

通過上述試驗(yàn)一般可以分離到相應(yīng)的菌株，但其在驗(yàn)證效果時(shí)卻發(fā)現(xiàn)不理想，最后鑒定的結(jié)果一般都是芽孢類菌株。導(dǎo)致這種結(jié)果的原因?yàn)楦患囵B(yǎng)時(shí)可能存在的降解菌并沒有很好地生長繁殖，數(shù)量也沒有明顯的增加，芽孢等卻迅速增長，而在馴化培養(yǎng)時(shí)加入目標(biāo)降解物，因?yàn)榄h(huán)境等惡劣變化，降解菌此時(shí)也不太可能迅速生長繁殖，而芽孢等卻可以通過孢子的形式存活下來，故在分離時(shí)芽孢等的數(shù)量反而占優(yōu)勢。這也解釋了現(xiàn)階段為何芽孢類的產(chǎn)品居多，因?yàn)槠浯婊钅芰軓?qiáng)。我們通過如此強(qiáng)烈針對(duì)性方法去篩選，最后卻很可能在驗(yàn)證降解能力時(shí)得到一次次失敗的結(jié)果，這個(gè)方法很可能是我們科研工作者的一廂情愿。

3 建議

筆者建議在進(jìn)行降解菌篩選時(shí)不要走捷徑，與其花費(fèi)很多時(shí)間與精力去尋找方法，不如踏踏實(shí)實(shí)地使用最原始的方法，即采取先將可能含有降解菌的樣品稀釋涂布于不同培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)24h后，得到多種菌株純培養(yǎng)物，再進(jìn)行菌株降解能力驗(yàn)證。本方法雖笨拙、工作量大，但卻穩(wěn)步向前，反而易達(dá)到目的，獲得相應(yīng)的降解菌株。

（通聯(lián)：430223，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所 電話：17771809619）