□ 王 英 黃山市食品藥品檢驗中心

食品中微生物檢驗技術探討

□ 王 英 黃山市食品藥品檢驗中心

微生物與人類的關系非常密切，絕大多數(shù)微生物對人類有益，但其中有一少部分微生物可引起人類的疾病。“民以食為天”，食品在生活中扮演著不可缺少的角色，食品中的微生物檢驗是食品檢驗中重要的一環(huán)。熟練掌握微生物檢驗技術，能提高檢驗人員的專業(yè)素質，保證檢驗結果的準確性和可靠性，還可以為生產(chǎn)企業(yè)做好食品質量控制提供科學依據(jù)。

微生物；檢驗技術；食品

隨著社會的發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，人們對視頻的要求不在只是裹腹之物，還有更多的要求，近幾年我國食品安全問題不斷出現(xiàn)，隨之食品安全問題成為大家關注的重中之重。隨著食品安全法的實施，食品標準發(fā)生了很大的變化，食品質量分析的重心逐漸偏向衛(wèi)生指標，如污染物限量、農(nóng)藥獸藥殘留、食品添加劑及微生物檢驗。微生物檢驗是衡量食品“衛(wèi)生”的重要指標，是衡量食品衛(wèi)生狀況及是否能食用的重要依據(jù)。食品微生物檢驗結果從側面反映出食品加工環(huán)節(jié)的一些現(xiàn)狀，為食品監(jiān)督管理工作提供一定的科學依據(jù)。目前國家衛(wèi)生標準中主要檢驗項目有菌落總數(shù)、大腸菌群、致病菌、霉菌和酵母等，本文從微生物檢驗的各環(huán)節(jié)分析，從而達到對微生物檢驗結果良好的控制。

1 微生物的基礎知識

1.1 基本概念

微生物是一些肉眼看不見的、低等的、原始的微小生物的總稱。微生物在自然界的分布很廣，到處都有它的存在，微生物種類多、繁殖快、代謝類型多、活性強、適應性強且易變異的特點。了解細菌的形態(tài)和結構特點，有助于人們更好的鑒別細菌，也為了解細菌的致病性和消毒滅菌打下基礎。

1.2 細菌的形態(tài)和結構

細菌的個體很小，一般要借助顯微鏡才能觀察到。細菌的基本形態(tài)有球菌、桿菌、螺旋菌三種，在鏡檢時就可以根據(jù)不同細菌形態(tài)鑒別。

細菌細胞的結構有一般結構和特殊結構，一般結構是任何細菌都具有的結構，特殊結構則是某些細菌所特有的結構，在細菌的分類鑒定中有重要的意義。細菌的特殊結構有鞭毛、莢膜和芽胞等。①鞭毛是長的絲狀物，它是細菌的運動器官，鞭毛的數(shù)目和排列方式可作為細菌分類的依據(jù)。通過特定的染色方法，加大直徑，就可在顯微鏡下觀察到。②芽胞是桿菌發(fā)育到一定程度在細胞內(nèi)形成的特殊構造。對外界環(huán)境有很強的抵抗力，一般在消毒滅菌時，必須達到消滅芽胞為標準。③莢膜是細胞壁外一層較厚的粘液性物質，它的生理功能是增強細菌的致病力、養(yǎng)料貯藏庫、堆積廢物、抵抗干燥。

1.3 微生物的生長繁殖

細菌生長所需的主要營養(yǎng)物質有水、碳源、氮源、無機鹽和生長因子。水提供細胞生長需要的氫和氧，碳源和氮源提供細菌生長需要營養(yǎng)元素。在微生物檢驗過程中，選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)基讓所檢驗的細菌更好的生長，有利于細菌計數(shù)、分離和鑒別。細菌的生長還需要控制一些其他因素，譬如細菌生長最適宜的酸堿度為7.2～7.6（個別細菌為pH8.0），溫度大都為36℃（也有28～42 ℃），細菌生長的氣體有氧氣和二氧化碳，主要看細菌是需氧型還是厭氧性，或者兼性厭氧。

細菌的繁殖主要以簡單的二分裂法繁殖，霉菌則是以孢子繁殖為主，酵母菌比較復雜，有無性繁殖和有性繁殖兩種。

2 微生物檢驗的基本技術

2.1 滅菌和消毒、無菌操作

微生物檢驗操作必須是無菌操作，無菌操作指培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，滅菌工具在無菌條件下接種含菌材料于培養(yǎng)基上。這意味著需要對實驗器皿、培養(yǎng)基及一些工具要滅菌消毒。消毒指應用消毒劑殺滅物體中病原微生物的方法，滅菌指殺滅物體中所有微生物的方法。為了使滅菌后能保持無菌狀態(tài)，各需滅菌的檢驗用品應放置在特定的容器內(nèi)或用合適的材料（如專用包裝紙、鋁箔紙等）包裹或加塞。常用的滅菌方法有一下幾種。

（1）干熱滅菌。將滅菌的檢驗用品放置烘箱內(nèi)，160～170 ℃維持1～2 h即可達到滅菌效果。適用于玻璃器皿、瓷器、金屬物品。

（2）濕熱滅菌。有高壓蒸汽滅菌、煮沸消毒法、巴氏消毒法和間歇滅菌法。其中高壓蒸汽滅菌是最常用的方法，在壓力為1.031 05 Pa，溫度在115～121 ℃保持15～30 min即可殺死各種微生物。適用于耐高熱和不怕潮濕的物品，如培養(yǎng)基、生理鹽水、玻璃器皿、金屬物品等。

（3）灼燒滅菌。指直接在火焰上燒灼滅菌，接種針、接種環(huán)、試管口、瓶口和剪刀鑷子可采用此法。

（4）輻射滅菌。有紫外線、β射線、γ射線。紫外線的穿透力弱，只適用于消毒直接照射的物體表面及空氣。一般無菌室、凈化工作臺的空氣消毒用紫外線殺菌。

（5）過濾除菌。指利用細菌不能通過致密具孔濾材的原理以除去氣體或液體中微生物的方法。常用于熱不穩(wěn)定的藥品溶液或原料的除菌。

（6）消毒劑殺菌。凡是可以殺死致病菌和有害微生物的化學藥品都是化學消毒劑。消毒劑主要用于皮膚表面和臺面等物體表面消毒。一般來多消毒劑的濃度越大，作用時間越長，殺菌力越強。但酒精除外，體積分數(shù)為75%濃度殺菌效果最好。

2.2 培養(yǎng)基制備技術

在實驗室配制的適合微生物生長繁殖和累積代謝產(chǎn)物的任何營養(yǎng)基質稱為培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基主要用于增菌培養(yǎng)、鑒別性培養(yǎng)；固體培養(yǎng)基用作微生物的分離、鑒定、檢驗雜菌、計數(shù)、保藏、生物鑒定等；半固體培養(yǎng)基用來觀察微生物動力，有時也用來保藏菌種。根據(jù)培養(yǎng)基的用途分通用培養(yǎng)基、增菌培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基的制備用水在GB4789.28-2013中有明確的要求，培養(yǎng)基的分裝也有一定要求，固體培養(yǎng)基約為試管高度的1/5，滅菌后制成斜面，分裝入三角瓶內(nèi)，以不超過其容積的1/2為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。目前培養(yǎng)基不限于實驗室自己配制，也可選擇購買培養(yǎng)基成品，不同的培養(yǎng)基成品有不同的配制和滅菌方法，應該嚴格按照說明書操作。對首次使用的培養(yǎng)基應進行質量測試。

在實驗過程中，存在培養(yǎng)基配制量偏多，可以放置于冰箱內(nèi)下次使用。當然不是無限期的保存，一般基礎培養(yǎng)基不能超過兩周，生化試驗培養(yǎng)基不宜超過一周，選擇性或鑒別性培養(yǎng)基最好當天使用，傾注的平板培養(yǎng)基不宜超過3 d。每次制備培養(yǎng)基均應有記錄，包括培養(yǎng)基名稱、配方來源及批號、滅菌溫度和時間、制備日期和制備者等信息[1]。

2.3 接種、分離和培養(yǎng)技術

微生物的接種方法很多，有劃線法、涂布法、傾注法、穿刺法、浸洗法和點值法等，要根據(jù)不同的目的選擇不同的接種方法。不同的接種方法使用不同的接種工具，比如移液槍、接種針、接種環(huán)和涂布棒等。選擇適合某種微生物生長的條件或加入抑制劑抑制其他微生物的生長，從而淘汰不需要的微生物的過程稱之為分離培養(yǎng)。值得指出的是分離純化的過場要經(jīng)過一系列的過程才能得到。

2.4 染色和鏡檢技術

經(jīng)過分離純化的微生物還要經(jīng)過結合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征后才能確定，需要掌握染色和鏡檢技術。微生物染色方法一般分為單染色法和復染色法。最常用的革蘭氏染色法就屬于復染色法，它是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，通過革蘭氏染色可以把細菌分成兩類：革蘭氏陽性菌G+和革蘭氏陰性菌G-，陽性菌和陰性菌染色結果的區(qū)別為陽性菌體呈紫色，代表菌有葡萄球菌、乳酸菌和李斯特菌；陰性菌體呈紅色，代表菌有大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌和假單胞菌。革蘭氏染色法包括四個步驟：初染、媒染、脫色、復染。

染色后的樣本經(jīng)過干燥后可用顯微鏡觀察，顯微鏡使用時先用低倍鏡觀察，然后用高倍鏡觀察，值得注意的是換上高倍物鏡后禁止向下轉動粗準焦螺旋。用顯微鏡觀察時，往往會由于操作過程中不慎沾染上污物，在視野中形成污點，影響觀察效果。因此需要及時判斷污點的位置以便于盡快將其清除。視野中出現(xiàn)的污染物不外乎三個位置：物鏡鏡頭、目鏡鏡頭和裝片。

2.5 鑒定技術

微生物的鑒定技術除了前面所說的染色鏡檢，還要對培養(yǎng)特性的觀察，主要從菌落特征、斜面和液體培養(yǎng)的特征、半固體穿刺培養(yǎng)的特征來鑒定微生物的重要形態(tài)，這就是微生物檢驗中的生理生化試驗和血清實驗。在這里需要注意的是不論是生化鑒定還是血清分型都必須使用純培養(yǎng)物。

3 微生物檢驗的采樣

在食品檢驗中，采樣時至關重要的，所采集的樣品必須具有代表性。樣品的采取、保存及運輸是否恰當，直接影響檢驗結果的正確性。微生物的樣品采集需注意一下幾點。

①采樣必須在無菌操作下進行，采樣用具及容器必須經(jīng)過滅菌，防止一切可能的外來污染。②采集后的樣品應立即送檢，運輸過程應保證樣品的完整，樣品送至化驗室若不能及時檢驗，應置于冰箱暫存。③采集的樣品應及時準確的記錄和標記。

隨著食品標準的更新，大部分食品的采樣方案已經(jīng)變成二級或三級方案。二級方案設有n、c、m值，即為n個樣品中，允許至多c個樣品檢驗值大于m值；三級方案設有n、c、m、M值，即為n個樣品中，允許全部樣品檢驗值小于m值，允許至多c個樣品檢驗值在m和M值之間，不允許有樣品的檢驗值大于M值。

4 微生物檢驗過程

食品樣品的檢驗應按照食品安全相關樣品前處理標準、檢驗方法標準的規(guī)定檢驗。2017年6月23日起，GB4789更新一些常用的檢驗方法標準，比如GB4789.1總則、GB4789.2菌落總數(shù)、GB4789.3大腸菌群、GB4789.4沙門氏菌和GB4789.10金黃色葡萄球菌都在此次更新范圍內(nèi)，GB 4789.15霉菌和酵母的計數(shù)在2017年4月19日已經(jīng)實施[2]。

除了檢驗方法標準之外，還應該知道樣品相應的產(chǎn)品標準或食品安全標準，在不知樣品污染情況下，一般根據(jù)檢驗項目的限量值來選擇合適的稀釋度。比如某樣品菌落總數(shù)不得超過105CFU，可以選擇10-1、10-2、10-3共3個稀釋度，因為只要在10-3平板上計數(shù)超過100，該樣品菌落總數(shù)就不符合要求了。

5 結語

由于食品中所含的微生物較多，產(chǎn)生影響因素也很多，為了提高檢驗質量，應該注意一下幾點：①食品的采樣工作是最為重要的，它直接影響檢驗結果的正確性，檢驗結果還關系到生產(chǎn)企業(yè)的經(jīng)濟效益、消費者的切生利益與安全.②食品微生物檢驗部門生物安全工作尤為重視，在檢驗工作過程中不僅要避免出現(xiàn)樣品污染，還要防止出現(xiàn)檢驗人員感染病原菌的問題。定期對檢驗環(huán)境清潔消毒，檢驗工作產(chǎn)生的廢棄物要統(tǒng)一處理。③由于微生物檢驗過程中需要檢驗人員有良好的分析能力與判斷能力，所以檢驗人員要掌握一定的技術原理，并嚴肅對待檢驗工作，保證微生物檢驗的工作質量。

[1]解慶先,王燕玲.糕點糖果檢驗技術[M].北京:中國計量出版社,1993.

[2]萬萍.食品微生物基礎與實驗技術[M].北京:科學出版社,2004.