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液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定雞肉中恩諾沙星和沙拉沙星殘留的國(guó)標(biāo)方法優(yōu)化

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針對(duì)國(guó)標(biāo)方法《GB/T 21312-2007 動(dòng)物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》中的雞肉中恩諾沙星和沙拉沙星殘留檢測(cè)存在耗時(shí)長(zhǎng)和過(guò)柱容易堵塞的問(wèn)題，從檢測(cè)方法參數(shù)如稱樣重量、離心機(jī)轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間等方面對(duì)上述國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的檢測(cè)方法有效地解決了國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)和提取的溶液過(guò)柱容易堵塞的問(wèn)題。

雞肉；恩諾沙星；沙拉沙星；離心機(jī)轉(zhuǎn)速；液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法

恩諾沙星和沙拉沙星屬于喹諾酮類藥物，國(guó)家指定為動(dòng)物專用藥，廣泛用于動(dòng)物疾病的治療。人長(zhǎng)期食用含有喹諾酮類藥物的動(dòng)物源性食品，喹諾酮類抗生素會(huì)在人體內(nèi)殘留蓄積，容易誘導(dǎo)耐藥性的傳遞，從而影響該類藥物的臨床療效。因此，喹諾酮類藥物殘留問(wèn)題越來(lái)越引起人們的關(guān)注，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織食品添加劑專家聯(lián)席委員會(huì)、歐盟已制定了多種喹諾酮類藥物在動(dòng)物組織中的最高殘留限量。加強(qiáng)動(dòng)物源性食品中喹諾酮藥物的檢測(cè)對(duì)食品安全具有重要意義，獲得快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法尤其重要。目前已有檢測(cè)食品中多種喹諾酮藥物殘留的國(guó)標(biāo)方法《GB/ T 21312-2007 動(dòng)物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》。但是，按國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)雞肉中恩諾沙星和沙拉沙星殘留，稱樣重量和某些條件（如離心機(jī)轉(zhuǎn)速、離心時(shí)間）并不是最優(yōu)條件，導(dǎo)致檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)、過(guò)柱容易堵塞等問(wèn)題，從而使檢測(cè)成本過(guò)高。本文優(yōu)化這些問(wèn)題方法，在確保準(zhǔn)確度的前提下獲得快速、成本較低的檢測(cè)方法[1]。

1 材料和方法

1.1 試劑和材料

檸檬酸（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）、甲醇（色譜純，Sigma）、乙腈（色譜純，Sigma）、甲酸（色譜純，Sigma）、氫氧化鈉（分析純）、乙二胺四乙酸二鈉（分析純）、一級(jí)水（符合GB/T6682-2008要求）、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（DR）、沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（DR）、HLB固相萃取柱（Waters）。

1.2 儀器

Waters Xevo-TQD超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀、Thermo RC 6PLUS落地高速離心機(jī)、FA1004N精密電子天平、pH700pH計(jì)、料理機(jī)、旋渦振蕩器、聚丙烯離心管、氮吹儀、SPE真空提取裝置20位。

1.3 方法

1.3.1 提取及凈化

（1）提取。稱取均質(zhì)試樣1.0 g（精確到0.1 g），置于50 mL聚丙烯離心管中，加入4 mL 0.1 mol/L EDTAMcllvaine緩沖液，1 000 r/min旋渦混合1 min，超聲提取10 min，1 8000 r/min離心15 min（溫度低于5 ℃），提取3次，合并上清液。

（2）凈化。HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL），使用時(shí)用6 mL甲醇洗滌、6 mL水活化。將步驟（1）提取液以2～3 mL/min的速度過(guò)柱，棄去濾液，用2 mL 5%甲醇水溶液淋洗，棄去淋洗液，將小柱抽干，再用6 mL甲醇洗脫并收集洗脫液。洗脫液用氮?dú)獯蹈?，? mL 0.2%甲酸水溶液溶解，1 000 r/min旋渦混合1 min，用于上機(jī)測(cè)定。

（3）基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備。將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液用初始流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成1、100、10 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。稱取與試樣基質(zhì)相應(yīng)的陰性樣品1.0 g，加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制成1、5、10、25、50、75、100 ng的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列，按照（1）、（2）與試樣同時(shí)提取和凈化。

1.3.2 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLCò BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）。

流動(dòng)相：A：純甲醇，B：0.2%甲酸水溶液。

流速：0.3 mL/min。

柱溫：40 ℃。

進(jìn)樣體積10 μL。

電離模式：電噴霧電離正離子模式（ESI+）。

質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。

被測(cè)物的母離子與子離子參數(shù)表見(jiàn)表1。

表1 被測(cè)物的母離子與子離子參數(shù)表

表2 不同樣重對(duì)過(guò)柱和氮吹時(shí)間的影響表

表3 不同樣重對(duì)恩諾沙星加標(biāo)回收率的影響表

表4 不同樣重對(duì)沙拉沙星加標(biāo)回收率的影響表

2 結(jié)果和分析

2.1 稱樣重量的選擇

國(guó)標(biāo)方法稱樣重量為5.0 g，0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖液體積為20 mL；優(yōu)化方法稱樣重量為1.0 g，0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖液體積為4 mL（按樣重同等比例縮小使用）。

結(jié)果表明，國(guó)標(biāo)方法提取的溶液過(guò)HLB柱凈化的時(shí)間和洗脫液用氮?dú)獯蹈傻臅r(shí)間長(zhǎng)，而優(yōu)化方法提取的溶液過(guò)HLB柱凈化的時(shí)間和洗脫液用氮?dú)獯蹈傻臅r(shí)間顯著縮短（表2）；優(yōu)化方法和國(guó)標(biāo)方法測(cè)得低、中、高3個(gè)濃度的加標(biāo)回收率（表3、表4）均符合《GB/T27404-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》的要求，優(yōu)化方法測(cè)得檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度滿足要求。

2.2 離心機(jī)轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間的選擇

國(guó)標(biāo)方法10 000 r/min離心5 min；優(yōu)化方法18 000r/min離心15 min。

結(jié)果表明，國(guó)標(biāo)方法提取的溶液過(guò)HLB柱凈化的時(shí)間明顯偏長(zhǎng)，而優(yōu)化方法提取的溶液過(guò)HLB柱凈化的時(shí)間明顯縮短（表5），優(yōu)化方法和國(guó)標(biāo)方法測(cè)得低、中、高三個(gè)濃度的加標(biāo)回收率（表6、表7）均符合《GB/ T27404-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》的要求，優(yōu)化方法測(cè)得的檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度滿足要求。

2.3 稱樣重量、離心機(jī)轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間的確定

國(guó)標(biāo)方法稱樣重量為5.0 g，0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖液體積為20 mL，10 000 r/min離心5 min；優(yōu)化方法稱樣重量為1.0 g，0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖液體積為4 mL，18 000 r/min離心15 min。

國(guó)標(biāo)方法提取的溶液過(guò)HLB柱凈化的時(shí)間和洗脫液用氮?dú)獯蹈傻臅r(shí)間長(zhǎng)，而優(yōu)化方法提取的溶液過(guò)HLB柱凈化的時(shí)間和洗脫液用氮?dú)獯蹈傻臅r(shí)間顯著縮短（表8）；優(yōu)化方法和國(guó)標(biāo)方法測(cè)得低、中、高三個(gè)濃度的加標(biāo)回收率（表9、表10）均符合《GB/ T27404-2008 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》的要求，優(yōu)化方法測(cè)得的檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度滿足要求。

3 討論

優(yōu)化后的方法與國(guó)標(biāo)方法的區(qū)別是稱樣重量由5 g減少到1 g，離心機(jī)轉(zhuǎn)速由10 000 r/min提高到18 000 r/min，離心時(shí)間由5 min延長(zhǎng)到15 min。優(yōu)化前，稱樣重量較多，導(dǎo)致提取的溶液體積較大，提取的溶液過(guò)HLB柱凈化的時(shí)間和洗脫液用氮?dú)獯蹈傻臅r(shí)間過(guò)長(zhǎng)；離心機(jī)轉(zhuǎn)速過(guò)低、離心時(shí)間過(guò)短，導(dǎo)致樣液離心不徹底，提取的溶液過(guò)HLB時(shí)柱容易堵塞，延長(zhǎng)凈化的時(shí)間。而優(yōu)化后，提取的溶液體積小和離心徹底，過(guò)柱時(shí)不容易堵塞，縮短了提取的溶液過(guò)HLB柱凈化的時(shí)間和洗脫液用氮?dú)獯蹈傻臅r(shí)間，同時(shí)減少了試劑和氮?dú)獾挠昧浚?、中、?個(gè)濃度的加標(biāo)回收率均符合《GB/T27404-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》的要求，在確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度的前提下大大降低了檢測(cè)成本。

表5 不同轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間對(duì)過(guò)柱時(shí)間的影響表

表6 不同轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間對(duì)恩諾沙星加標(biāo)回收率的影響表

表7 不同轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間對(duì)沙拉沙星加標(biāo)回收率的影響表

表8 不同樣重、轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間對(duì)過(guò)柱和氮吹時(shí)間的影響表

表9 不同樣重、轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間對(duì)恩諾沙星加標(biāo)回收率的影響表

表10 不同樣重、轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間對(duì)沙拉沙星加標(biāo)回收率的影響表

4 結(jié)論

優(yōu)化后檢測(cè)方法的稱樣重量為1 g，試樣液18 000 r/min離心15 min，低、中、高3個(gè)濃度的加標(biāo)回收率均符合《GB/T27404-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》的要求，優(yōu)化方法測(cè)得的檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度滿足要求。優(yōu)化方法提取的溶液體積小，離心徹底，過(guò)HLB柱不容易堵塞，顯著縮短了提取的溶液過(guò)HLB柱凈化的時(shí)間和洗脫液用氮?dú)獯蹈傻臅r(shí)間，同時(shí)減少了試劑和氮?dú)獾挠昧?。?yōu)化后的檢測(cè)方法快速、節(jié)省了成本，并且保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。

[1]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 21312-2007 動(dòng)物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2007.