■文/貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 劉金平

c-fos基因在麻醉藥麻醉機(jī)理研究中的應(yīng)用

■文/貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 劉金平

c-fos基因是一種存在于正常神經(jīng)核內(nèi)的原癌基因，具有高度保守性。c-fos基因當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時(shí)，c-fos基因便迅速表達(dá)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯等一系列過(guò)程形成Fos蛋白。麻醉藥的使用會(huì)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)中c-fos基因的表達(dá)，可以根據(jù)c-fos基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯情況從基因和蛋白質(zhì)的水平研究麻醉藥的麻醉機(jī)理，這為麻醉藥的研究提供了一個(gè)思路。

c-fos基因；Fos蛋白；獸用麻醉藥

C-fos基因的研究可以追溯到20世紀(jì)80年代中后期，它是FBJ和FBR小鼠肉瘤病毒(MSVs)中病毒癌基因v-fos細(xì)胞同源序列。通過(guò)基因比對(duì)發(fā)現(xiàn)，人與小鼠的相同序列高達(dá)94%，非常保守。人的c-fos基因位于14q16～31，是一個(gè)包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子的DNA片段，其長(zhǎng)度為9kb[1,2]。在受到外界刺激時(shí)，c-fos基因可轉(zhuǎn)錄為mRNA c-fos，進(jìn)一步翻譯為Fos蛋白。根據(jù)c-fos基因的特點(diǎn)建立了c-fos技術(shù)，就是利用機(jī)體受到刺激時(shí)c-fos基因表達(dá)量迅速增加和產(chǎn)物Fos蛋白堆積于細(xì)胞核內(nèi)的特點(diǎn)，采用原位雜交、免疫組化和蛋白印跡等方法來(lái)研究神經(jīng)元功能的技術(shù)。

隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，獸用麻醉藥使用逐漸普遍。獸醫(yī)臨床手術(shù)中的應(yīng)用最為常見(jiàn)，其能夠減少動(dòng)物在治療過(guò)程中的痛苦，同時(shí)使動(dòng)物處于安靜狀態(tài)，方便醫(yī)務(wù)人員進(jìn)行治療[3]；麻醉藥為野生動(dòng)物體格檢查和日常管理提供方便[4]；近年來(lái)，麻醉藥應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)保活運(yùn)輸中，在長(zhǎng)距離長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸過(guò)程中，外界的應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致肉質(zhì)損傷[5]，甚至出現(xiàn)魚(yú)類(lèi)的死亡，合理地使用麻醉藥可以降低魚(yú)類(lèi)的應(yīng)激，減少魚(yú)類(lèi)的死亡率，MS-222(3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽)已被美國(guó)國(guó)家食品及藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)為漁用麻醉劑[6]，丁香酚作為一種麻醉劑，因具有價(jià)格低廉、對(duì)人體健康無(wú)害、休藥期短、不會(huì)誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生突變物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)也被廣泛應(yīng)用在魚(yú)類(lèi)的運(yùn)輸中[7]。

麻醉藥的使用帶來(lái)諸多好處，掌握麻醉藥在機(jī)體內(nèi)的作用機(jī)理是麻醉藥臨床使用的前提，這可以為臨床使用中出現(xiàn)意外提供合理解決方案。近年來(lái)，對(duì)獸用麻醉藥作用機(jī)理的研究主要分為動(dòng)物行為水平的研究、基因水平的研究、蛋白水平的研究等，本文就麻醉藥使用后c-fos基因的表達(dá)情況進(jìn)行探討和分析。

1 c-fos基因

原癌基因家族中，有一類(lèi)基因能夠接收第二信使的信號(hào)，使細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)化為調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)基因表達(dá)的信號(hào)，進(jìn)行核內(nèi)蛋白的編碼，調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能的改變，這類(lèi)基因被稱(chēng)為“即刻早期基因”(immediate early gene，EG)，是目前較為理想的腦功能活動(dòng)的定位標(biāo)記[8]。這類(lèi)基因在正常生理情況下表達(dá)量很少，但當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時(shí)能迅速表達(dá)、堆積形成蛋白，可以通過(guò)原位雜交或免疫組化等技術(shù)來(lái)進(jìn)行研究。目前已發(fā)現(xiàn)的EG有十幾種，按它們的結(jié)構(gòu)和功能特征大致分為c-fos家族、c-jun家族、c-myc家族和egr家族[9]。目前研究比較多的是c-fos基因和c-jun基因。

c-fos基因普遍存在動(dòng)物體內(nèi)各組織器官中，且中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布最為廣泛，參與腦各種活動(dòng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控過(guò)程[10]。具體的調(diào)節(jié)機(jī)制如下：第一類(lèi)，Ca2+-鈣調(diào)蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、cAMP依賴(lài)性蛋白激酶(PKA)磷酸化激活途徑、甘油二酯依賴(lài)的蛋白激酶C(PKC)途徑[11]；第二類(lèi)，興奮性氨基酸(EAA)受體和G-蛋白偶聯(lián)受體(速激肽、腎上腺素能和α-MSH受體)誘導(dǎo)途徑[12]；第三類(lèi)，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體激活途徑[13]；第四類(lèi)，絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)途徑[14]。

2 Fos蛋白

Fos蛋白是c-fos基因轉(zhuǎn)錄、翻譯的產(chǎn)物。機(jī)體受到外界刺激時(shí)，c-fos基因被迅速激活轉(zhuǎn)錄形成c-fos mRNA，可在刺激30～45min達(dá)高峰期，12min為半衰期，編碼形成由380個(gè)氨基酸組成的核內(nèi)蛋白Fos，F(xiàn)os蛋白可在刺激20～90min檢測(cè)出來(lái)，60～90min達(dá)高峰期，持續(xù)時(shí)間為2～5h，半衰期為2h[15]。形成的FOS蛋白經(jīng)過(guò)一系列過(guò)程完成細(xì)胞核內(nèi)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此被稱(chēng)為核內(nèi)“第三信使”[16]。

中樞Fos蛋白具有多種功能，常被用作神經(jīng)元激活的標(biāo)志。①FOS蛋白參與機(jī)體細(xì)胞的正常分化、生長(zhǎng)以及中樞的學(xué)習(xí)、記憶等過(guò)程；②藥物研究方面，目前已經(jīng)有研究表明FOS蛋白的表達(dá)可以用于偏頭痛、麻醉等種類(lèi)藥物的篩選、用藥后的藥效評(píng)價(jià)和疾病發(fā)病機(jī)理研究模型的建立；③在臨床上，通常作為提示腦部受傷時(shí)間的參考指標(biāo)，當(dāng)腦部受傷時(shí)，根據(jù)FOS蛋白堆積的數(shù)量可以判斷受傷時(shí)間；④FOS蛋白的表達(dá)還是細(xì)胞終末分化的標(biāo)志及發(fā)生死亡的先兆[17]。總的來(lái)說(shuō)，F(xiàn)os蛋白的表達(dá)可以用于各個(gè)方面的研究，為科研工作者在蛋白水平的研究提供了一個(gè)思路。

3 麻醉藥作用機(jī)理的研究概況

全麻藥的作用機(jī)理有很多種說(shuō)法，比較多的是“脂質(zhì)學(xué)說(shuō)”、“蛋白質(zhì)學(xué)說(shuō)”、“突觸學(xué)說(shuō)”等。近來(lái)的研究表明，全麻藥的作用機(jī)理是多機(jī)制、多效應(yīng)、多部位和多靶點(diǎn)的共同作用[18]，藥物進(jìn)入機(jī)體選擇性的作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同部位或神經(jīng)通路，主要的作用靶點(diǎn)包括受體、離子通道、酶等[19]，研究較多的NMDA受體[20]、神經(jīng)煙堿受體[21]、GABA A受體[22～25]等，中樞神經(jīng)系統(tǒng)cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、中樞神經(jīng)系統(tǒng)NO-cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶等。而對(duì)于局麻藥和靜脈麻醉藥的作用機(jī)理還不太清楚，有待進(jìn)一步研究。

4 c-fos基因在麻醉藥作用機(jī)理中的研究概況

在麻醉藥作用機(jī)理的研究中，c-fos基因已有較多報(bào)道。楊軍等[26]在異丙酚麻醉大鼠實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶聯(lián)反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白印跡技術(shù)(Western Blot)分析異丙酚對(duì)大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)海馬各區(qū)c-fos、c-jun基因及蛋白表達(dá)的影響中發(fā)現(xiàn)，注射異丙酚后，大鼠的海馬CA1區(qū)和DG區(qū)c-fos、c-jun基因和蛋白的表達(dá)水平顯著升高，且隨著異丙酚濃度的增加其升高趨勢(shì)越明顯，而海馬CA3區(qū)未發(fā)現(xiàn)異丙酚對(duì)c-fos、c-jun基因和蛋白表達(dá)水平的影響，最終得出異丙酚可能通過(guò)影響c-fos、c-jun基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用實(shí)現(xiàn)麻醉功能，且此作用部位具有顯著差異性。李小波[27]研究表明，小型豬復(fù)合麻醉劑及塞拉嗪對(duì)大鼠的大腦皮層、丘腦、腦干、小腦、海馬5個(gè)腦區(qū)c-fos mRNA的表達(dá)有上調(diào)作用，從而推斷5個(gè)腦區(qū)可能是麻醉藥的作用部位，誘導(dǎo)c-fos mRNA的表達(dá)可能是小型豬復(fù)合麻醉劑及賽拉嗪的作用機(jī)制之一。孫凱[15]通過(guò)給大鼠腹腔注射不同劑量異丙酚發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)不同腦區(qū)Fos蛋白的表達(dá)發(fā)生變化，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，推測(cè)異丙酚的麻醉作用可能與Fos蛋白有關(guān)，具體有待進(jìn)一步研究。尹柏雙等[29]給大鼠腹腔注射小型豬特異性麻醉劑(XFM)的拮抗劑阿替美唑，研究阿替美唑?qū)Υ笫蟠咝雅cc-fos基因的關(guān)系得出結(jié)論，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的c-fos基因參與XFM麻醉作用，拮抗劑阿替美唑誘導(dǎo)大腦皮層Fos蛋白的表達(dá)，可能是阿替美唑催醒XFM麻醉大鼠的重要機(jī)理之一。

5 c-fos基因在麻醉藥作用機(jī)理中的研究展望

c-fos基因可以作為臨床藥物研究的觀察指標(biāo)，同時(shí)提供了藥物研究的一些新思路。不管麻醉藥的作用對(duì)c-fos基因的表達(dá)是抑制作用還是促進(jìn)作用，都可以從兩個(gè)不同的層面去思考麻醉機(jī)理。一是從c-fos mRNA方面，提取總mRNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，運(yùn)用RT-PCR得到擴(kuò)增曲線和溶解曲線，比較麻醉前后c-fos mRNA的表達(dá)量，找出麻醉藥對(duì)c-fos mRNA表達(dá)起抑制還是表達(dá)作用，再討論麻醉藥的作用機(jī)理。二是從Fos蛋白方面。目前這方面的研究已有報(bào)道，一些麻醉藥使用后會(huì)促進(jìn)Fos蛋白的形成，這時(shí)可以直接利用免疫組化或原位雜交技術(shù)確定Fos蛋白的表達(dá)量，也有一些麻醉藥會(huì)抑制Fos蛋白的表達(dá)，這時(shí)可以借助外界刺激使Fos蛋白表達(dá)增加，一定時(shí)間后使用麻醉藥，用上述的方法看麻醉藥對(duì)Fos蛋白的抑制作用，分析麻醉藥的作用機(jī)理。

根據(jù)上述兩個(gè)方面的研究，麻醉藥的作用機(jī)理存在兩種可能性。①可能直接影響c-fos基因的表達(dá)，而如何影響c-fos基因的表達(dá)，c-fos又是如何發(fā)揮麻醉鎮(zhèn)痛作用，這將是以后麻醉藥作用機(jī)理研究的一個(gè)方向。②可能作用于某一受體，然后影響c-fos基因的表達(dá)，這時(shí)可以利用受體的激動(dòng)劑或拮抗劑控制麻醉藥的作用，觀察c-fos基因的表達(dá)情況，當(dāng)使用某一受體的激動(dòng)劑或拮抗劑，c-fos基因的表達(dá)量發(fā)生變化時(shí)，就可以推測(cè)該麻醉藥可能是作用于這一受體，具體如何作用還需進(jìn)一步探討。

6 結(jié)語(yǔ)

c-fos基因在獸用麻醉藥麻醉過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但c-fos基因如何參與麻醉過(guò)程、麻醉藥物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)c-fos基因表達(dá)影響的具體機(jī)理等報(bào)道較少，沒(méi)有形成系統(tǒng)的、清晰的思路，因此從c-fos基因方面研究獸用麻醉藥的作用機(jī)理具有重要意義。明確麻醉藥的具體作用機(jī)理，是研發(fā)一種新型麻醉藥的必需過(guò)程，同時(shí)為尋找麻醉藥合適的激動(dòng)劑和拮抗劑提供幫助，激動(dòng)劑和拮抗劑的使用可以更好地控制藥物效果和作用時(shí)間長(zhǎng)短；預(yù)防麻醉藥使用過(guò)程中遇到的突發(fā)狀況，提前制定合理方案?！?/p>

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