盧祥婷 Arun Karki 黃欣 趙敬軍

(上海市同濟醫(yī)院皮膚科 同濟大學附屬同濟醫(yī)院，上海 200065)

·綜述·

激光治療甲真菌病的作用機制研究進展

盧祥婷 Arun Karki 黃欣 趙敬軍

(上海市同濟醫(yī)院皮膚科 同濟大學附屬同濟醫(yī)院，上海 200065)

甲真菌病是皮膚科常見的甲病變，指真菌引起的甲板和 (或)甲下組織的感染。由于抗真菌藥種類較少及其毒副作用，肝腎功能受損的甲真菌病患者，缺乏安全、有效的藥物。近年來，以激光作為主要或輔助手段治療甲真菌病備受國內(nèi)外學者的關注，現(xiàn)就激光治療甲真菌病作用機制的研究進展進行綜述。

激光；甲真菌??；治療；作用機制

[Chin J Mycol，2017，12(3):171-174]

甲真菌病是一種由真菌感染甲板和 (或)甲床的疾病，占所有皮膚真菌感染性疾病的 30%，是皮膚科常見病、多發(fā)病，其患病率約占所有甲疾病的50%和所有皮膚感染性疾病的10%[1-2]。Sigurgeirsson等[3]認為紅色毛癬菌是甲真菌病最常見的致病菌，其臨床分離率高達80%[4]。甲真菌病不僅影響美觀且易引起繼發(fā)感染[3]。甲真菌病的治療一直都是臨床上的難題，局部外用抗真菌藥物、系統(tǒng)口服抗真菌藥物以及手術或化學拔甲術等都屬于傳統(tǒng)治療方法，存在一定的局限性。由于甲板結構致密，局部外用抗真菌藥物較難滲透到病變部位，因此大大降低了藥物的療效且治療時間也較長，一定程度上也降低了患者的依從性；口服抗真菌藥雖然對甲真菌病有效，但具有一定的肝毒性等副作用，患有肝腎疾病的患者、兒童以及老年患者不宜應用。外科或化學拔甲術創(chuàng)傷大，嚴重影響患者的美觀和生活質(zhì)量，且易復發(fā)。

因此，尋找一種更安全、有效、操作方便的甲真菌病治療方法勢在必行。近年來，激光治療甲真菌病受到國內(nèi)外學者的關注，其療效較好，無明顯副作用，尤其適用于年老、免疫力低下和肝腎功能不全的患者，在臨床上已逐漸推廣使用[5]。目前臨床上常用于治療甲真菌病的激光器類型主要包括:長脈沖Nd∶YAG1064nm激光器、短脈沖Nd∶YAG1064nm激光器、CO2激光器、波長870nm+930nm激光器、光動力療法等，現(xiàn)就其不同類型的激光治療甲真菌病的作用機制概述如下。

1 臨床治療甲真菌病常用激光類型及作用機制

1.1 長脈沖Nd∶YAG1064nm激光治療甲真菌病的作用機制

目前，長脈沖1064nmNd∶YAG激光治療甲真菌病是國內(nèi)外學者研究最多的激光器。對不同類型的甲真菌病均具有較好的療效，安全、有效，對于兒童、老年人、免疫力低下及肝腎功能不佳的甲真菌病患者具有獨特的治療優(yōu)勢。目前美國食品與藥品管理局 (Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)已經(jīng)批準了包括長脈沖1064nmNd∶YAG激光在內(nèi)的多種激光設備用于治療甲真菌病，它能夠暫時性地促進甲真菌病患者新甲的增長[6]。

國外有眾多學者對Nd∶YAG激光治療甲真菌病進行了臨床療效觀察，顯示有一定療效[7-8]。Ghavam等[9]在一項體外研究實驗中發(fā)現(xiàn)低功率激光照射對真菌的生長沒有任何抑制作用，而Q開關Nd∶YAG532nm激光能量8 J/cm2，Q開關Nd∶YAG1064nm激光能量4～8 J/cm2和脈沖染料激光 (Flashlamp-pumped dye laser)能量8 J/cm2，595 nm的激光能量14 J/cm2可有效抑制紅色毛癬菌生長。禚風麟等[10]在研究長脈沖Nd∶YAG1064nm激光對紅色毛癬菌生長及超微結構影響的實驗中分別用不同能量的激光200 J/cm2、400 J/cm2、600 J/cm2照射等量的紅色毛癬菌，在電鏡下觀察到紅色毛癬菌菌絲的破壞，細胞壁的缺損，細胞膜皺縮、破裂，染色質(zhì)凝聚等的程度以及細胞內(nèi)空泡狀結構和高電子密度凝集塊的數(shù)量都隨著激光能量的增加而增加。說明不同激光能量的Q開關Nd∶YAG1064nm能不同程度地損壞紅色毛癬菌的超微結構，且損壞的程度與激光能量呈正相關。Galvan Garcia[11]認為波長1 064 nm的Nd∶YAG激光能不斷地產(chǎn)生高能量的波峰穿透甲板到達甲床部位，產(chǎn)生局部高溫從而抑制真菌生長并引起細胞損傷和死亡。它產(chǎn)生的沖擊能量只針對真菌產(chǎn)生機械損傷作用，而不加熱人體組織，因此不引起疼痛。他認為激光治療甲真菌病是通過“選擇性光熱作用”原理來實現(xiàn)的，即根據(jù)顏料類型、使用光的類型和脈沖頻率，即光+熱+沖擊力來達到抑制/殺滅真菌的目的。而Vural等[12]認為Q開關Nd∶YAG激光對真菌菌落的抑制作用最有可能是由于非特異性熱損傷。有研究報道：532 nm的Q開關Nd∶YAG激光能夠很好抑制紅色毛癬菌，這是因為紅色毛癬菌中含有大量的黃麥格霉素，它能夠很好地吸收這一波長的激光。雖然Q開關Nd∶YAG激光波長在1 064 nm超出了黃麥格霉素的吸收光譜，但臨床上它對紅色毛癬菌亦有類似的抑制作用，這可能是由于毛癬菌物種的細胞壁含有大量的黑色素，這個發(fā)色基團的吸收光譜為1 064 nm[13]，所以長脈沖Nd∶YAG1064nm激光是基于選擇性光熱作用原理發(fā)展而來的，激光作用于真菌組織中的發(fā)色基團，發(fā)色基團吸收足夠的熱量，繼而轉化為熱能，使真菌組織溫度升高，從而達到破壞真菌的作用。Nd∶YAG激光能有效地深入甲床到達真菌菌落繁殖的部位，將甲面溫度控制在43～51℃，使真菌喪失繁衍的能力，進而抑制真菌，使指 (趾)甲恢復正常形態(tài)。

亦有研究表明UV、熱應激、H2O2等外界因素主要通過誘導線粒體凋亡途徑從而引起真菌凋亡[14]。其中由線粒體產(chǎn)生的活性氧簇 (reactive oxygen sprcies，ROS)，是介導真菌細胞凋亡的主要分子，ROS主要包括過氧化氫 (hydrogen peroxide，H2O2)、羥自由基 (hydroxyl radical，OH-)、超氧離子 (O2-)等。誘導真菌凋亡的主要方式是ROS介導的氧化還原反應。據(jù)此，禚風麟等[14]認為ROS可能在長脈沖1064nmNd∶YAG激光照射后能抑制紅色毛癬菌的生長，并在激光治療甲真菌病中起主要作用。在體外實驗中，隨著激光能量密度的增加，紅色毛癬菌菌體內(nèi)的H2O2含量逐漸升高，而OH-、抗O2-自由基活力受抑制、超氧化物歧化酶活力也逐漸減弱，故推測在激光照射后菌體發(fā)生熱休克時，菌體內(nèi)ROS含量驟升，破壞了菌體內(nèi)氧化平衡系統(tǒng)，損壞菌體結構，改變了線粒體膜的跨膜電位，導致細胞色素C從線粒體中釋放，啟動細胞凋亡蛋白酶大量表達，導致菌體發(fā)生程序性死亡，隨著激光能量的不斷增加，菌體最終發(fā)生壞死、崩解。

長脈沖Nd∶YAG1064nm激光波長長、能量高、操作簡單、穿透力強、不誘發(fā)基因突變等優(yōu)點得到了學者們的認可。長脈沖Nd∶YAG1064nm激光抑制真菌不僅與其激光治療次數(shù)和優(yōu)化治療參數(shù)有關，亦與其作用機制有關[15]。因此若想達到最佳治療效果，對于其治療甲真菌病的具體機制仍需要進一步深入研究。

1.2 短脈沖Nd∶YAG1064nm激光治療甲真菌病的作用機制

對于短脈沖Nd∶YAG1064nm激光器治療甲真菌病的臨床研究甚少，短脈沖Nd∶YAG是脈沖寬度 (即納秒)相對較短的激光。短脈沖作用于病甲可引起微小氣泡的形成和聲波沖擊波，進而能顯著抑制真菌菌落的生長[16]。短脈沖時間遠短于熱弛豫時間也會引起熱沖擊，通過快速加熱和冷卻靶組織的發(fā)色基團，連續(xù)的使用短脈沖可產(chǎn)生極端的熱循環(huán)和沖擊波從而對真菌產(chǎn)生機械損傷，短脈沖Nd∶YAG1064nm能有效抑制紅色毛癬菌的生長。其中Hochman[16]選取了8例患者，7例為趾甲真菌病，1例為指甲真菌病，采用此激光以脈沖0.65 ms，光斑直徑2 mm，能量密度223 J/cm2來照射，2～3次為1個療程，每個療程間隔至少3周，治療2～3個療程后，結果并不理想，其臨床應用及其作用機制仍有待廣大的學者和臨床醫(yī)生進一步的研究和探索。

1.3 CO2激光治療甲真菌病的作用機制

CO2激光是最早用于治療皮膚科疾病的激光，近年來開始用于甲真菌病的治療，治愈率較高[17]。劉進芬等[18]對44例甲真菌病病人共92個病甲采用每2周1次CO2激光燒灼打孔,療程共24周。研究結果顯示：CO2激光治療甲真菌病的有效率達90%。CO2激光治療甲真菌病，據(jù)報道其作用機制大體可分為：(一)光熱作用：CO2激光運用光熱原理可使真菌組織受熱，從而使病灶部位的真菌組織內(nèi)的水轉變?yōu)檎羝?，體積發(fā)生膨脹，真菌體內(nèi)壓力增加，從而發(fā)生局限性的微爆炸，最終被分解代謝;較高的局部溫度，亦可直接殺滅真菌。(二)真菌細胞熱損傷:輕到中度的溫度增加可導致氫鍵和范德華鍵斷裂，引起酶和功能的變化。通常在特定溫度下 (如超過40℃)真菌便可發(fā)生熱損傷從而導致真菌的某些蛋白變性或失活，反復的熱效應持續(xù)刺激真菌最終達到抑菌或殺菌的作用[19]。據(jù)報道在一個相對較窄的溫度范圍內(nèi)，隨著激光誘導的熱應激作用的增強熱休克蛋白 (heat shock protein,HSP)的表達也隨之增多，因此檢測HSP的含量亦可反應出真菌細胞受損的程度。(三)病甲經(jīng)過CO2激光處理后更容易修剪，有利于新甲的生長。近年來有研究學者采用CO2點陣激光聯(lián)合光動力療法治療甲真菌病，療效亦很好[17]。CO2激光治療甲真菌病方法簡便、費用低、患者易堅持、且無明顯不良反應，特別適用于老年、肝腎功能受損以及免疫功能低下的患者，在臨床上已逐漸開展使用，但有關CO2激光治療甲真菌病時使用激光的能量密度、波長和燒灼的深度和廣度以及如何更加有效地發(fā)揮激光的抑菌/殺菌的作用仍有待于進一步的探索和總結其作用機制。

1.4 波長870nm+930nm激光治療甲真菌病的作用機制

870nm+930nm激光器是一種雙波長激光器，它可以發(fā)射波長為870 nm和930 nm的近紅外光，通過該激光器的光熱作用來治療甲真菌病[14]。870nm+930nm二極管激光器的激光能通過作用于線粒體膜引起線粒體跨膜電位下降，活性氧ROS產(chǎn)生增加而發(fā)揮作用。體外實驗證實該激光器對毛癬菌屬、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白念珠菌均有抑制/殺滅的作用[20]。

1.5 光動力療法 (Photodynamic Therapy，PDT)治療甲真菌病的作用機制

PDT是近年來興起的一種治療皮膚病的全新技術，在光敏劑5-氨基乙酰丙酸 (5-aminolevulinic acid，5-ALA)和一定的激光光源下發(fā)生光動力學反應從而生成具有殺傷細胞作用的單態(tài)氧，從而選擇性的破壞病變組織。5-ALA-PDT被證明可以有效殺死細菌、真菌等微生物[21]，Kamp[22]的體外實驗亦提供了5-ALA-PDT治療甲真菌病的理論依據(jù)，在培養(yǎng)紅色毛癬菌的液體培養(yǎng)基中加入5-ALA，紅色毛癬菌能將5-ALA轉化為光活性的光敏劑原卟啉Ⅸ (PpIX)，然后經(jīng)一定波長的激光照射，在氧存在的條件下，氧從其正常狀態(tài)下的基態(tài)氧-三重態(tài)轉變?yōu)槭芗ぐl(fā)狀態(tài)的單態(tài)氧，激發(fā)態(tài)的單態(tài)氧再與特定的生物分子發(fā)生反應，攻擊真菌的胞漿和細胞內(nèi)膜，使真菌菌落數(shù)目減少，直徑變小，從而能有效地抑制紅色毛癬菌的生長。真菌體內(nèi)PpIX的生成水平?jīng)Q定了PDT抗真菌化學療法的療效，在真菌體內(nèi)亦存在調(diào)節(jié)合成PpIX的反饋系統(tǒng)，當ALA用量過多時，真菌細胞會合成過量的PpIX，如果此時不發(fā)生光動力學反應，光活性的PpIX在真菌體內(nèi)亞鐵螯合酶的作用下與Fe3+結合生成血紅素[23]，導致真菌體內(nèi)PpIX的水平降低從而減弱/失去其抑制/殺滅真菌的作用。另外體外實驗證實5-ALA-PDT通過光化學反應產(chǎn)生大量的ROS和硝基化產(chǎn)物能有效抑制/殺滅紅色毛癬菌[24]。但是由于體外培養(yǎng)條件下的紅色毛癬菌、白念珠菌的增殖及感染的程度與人體受感染甲的實際情況存在一定的差別，因此進一步研究5-ALA-PDT抗菌的作用機制仍需要大量的動物實驗，從而為臨床治療甲真菌病奠定理論基礎。

2 展望及小結

雖然激光治療甲真菌病結果類似，但不同的激光器在作用機制及使用方法上存在一定差異。因此，臨床醫(yī)生應熟悉不同種類激光儀器的作用原理，設置最佳的治療參數(shù)和療程。

目前國外批準上市的激光治療器用于甲真菌病的治療已在臨床上逐漸推廣使用，它高效、安全、無明顯副作用[25]，給不適合口服藥物治療甲真菌病的患者帶來新的希望，但激光治療甲真菌病引起的疼痛亦較常見。國內(nèi)外有研究報道局部外用表面麻醉劑復方利多卡因軟膏可有效減輕病人的疼痛感，且較安全，患者對治療的滿意度較高[26-27]。目前激光治療甲真菌病的作用機制國內(nèi)、外研究甚少，我們?nèi)孕柽M一步明確激光治療甲真菌病的作用機制，以便更好地治療甲真菌病。

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[本文編輯] 王 飛

·綜述·

Advances on the mechanism of laser therapy for onychomycosis

LU Xiang-ting,Arun Karki,HUANG Xin,ZHAO Jing-jun

(DepartmentofDermatology,ShanghaiTongjiHospital,AffiliatedTongjiHospitalofTongjiUniversity,Shanghai200065,China)

Onychomycosis is the most common nail disease in Department of Dermatology.It refers to the fungal infection of nail plate or nail bed with higher incidence in the general population.There is little safe,effective and alternative medicine for onychomycosis due to the side effects of drugs and the fewer kinds of antifungal drugs,especially in patients with impaired liver and kidney function.In recent years,domestic and foreign scholars pay close attention to laser as the main and auxiliary means for treatment of onychomycosis.The research progress on the mechanism of laser treatment of onychomycosis is addressed in this review.

laser;onychomycosis;therapy;mechanism

上海市科委自然科學基金 (17ZR1426300,13ZR1437900)；促進市級醫(yī)院臨床技能與臨床創(chuàng)新三年行動計劃 (16CR4034A)

盧祥婷，女 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:lxtns15@163.com；Arun Karki,男 (尼泊爾)，碩士研究生在讀.E-mail:karki_arun@rocketmail.com

黃欣,E-mail:alida_huang@163.com

R 756.4

A

1673-3827(2017)12-0171-04

2017-02-22