周艷萌 向曉波 馮琳穎 董華

(1.遵義醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔外科；3.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與科技學(xué)院2011級(jí)；4.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與科技學(xué)院2012級(jí)，遵義 563003)

·技術(shù)與方法·

兩種檢測(cè)方法評(píng)價(jià)厚樸對(duì)白念珠菌黏附的影響

周艷萌1向曉波2馮琳穎3董華4

(1.遵義醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔外科；3.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與科技學(xué)院2011級(jí)；4.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與科技學(xué)院2012級(jí)，遵義 563003)

XTT法；結(jié)晶紫法；白念珠菌；黏附

白念珠菌是人體常見的機(jī)會(huì)致病性真菌，可存在于正常人口腔、上呼吸道、腸道及陰道，易在義齒、人工插管如尿道插管、氣管插管等植入性設(shè)備表面定植并進(jìn)一步形成生物膜。生物膜的形成可保護(hù)菌體免受藥物的殺傷和免疫系統(tǒng)的攻擊。黏附是生物膜成膜的關(guān)鍵，也是白念珠菌致病的關(guān)鍵步驟[1]。本實(shí)驗(yàn)擬通過結(jié)晶紫法與XTT法觀察中藥厚樸對(duì)白念珠菌黏附的影響，并對(duì)兩種檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

白念珠菌 (ATCC 10231)由遵義醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。厚樸購于遵義市芝林大藥房。RPMI1640培養(yǎng)基 (GIBCO公司),YPD液體培養(yǎng)基依據(jù)文獻(xiàn)配制[2]，1%結(jié)晶紫染液 (結(jié)晶紫粉末2 g,溶于20 mL無水乙醇。草酸銨0.8 g，溶于80 mL蒸餾水。將兩者充分混勻過濾備用)[3]，XTT/PMS應(yīng)用液按照試劑盒說明書配置。二甲基亞砜 (DMSO)(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，分析純)。

1.2 方法

白念珠菌先在沙氏瓊脂培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，然后接種于YPD液體培養(yǎng)基。

厚樸煎煮液的制備 厚樸為烤干的生藥，按戴自英[4]提供的方法制備生藥濃度為1 g/mL的水煎液,濾器過濾除菌后，用RPMI1640培養(yǎng)液按二倍稀釋法將厚樸煎煮液稀釋成以下濃度:125、62.5、31.3、15.6和7.8 μg/mL。

結(jié)晶紫法檢測(cè)厚樸煎煮液對(duì)白念珠菌黏附作用的影響 濃度為1×106cells/mL的菌液接種于96孔板中，每孔100 μL菌液，37℃分別培養(yǎng)1 h、2 h和3 h后，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗去未黏附菌[5]，每孔加入上述各濃度藥液100 μL，每組8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照孔 (含菌液培養(yǎng)基)及空白對(duì)照孔，37℃培養(yǎng)24 h，每孔加入1%的結(jié)晶紫染液150 μL染20 min后，PBS洗3次，每孔加入150 μL 95%乙醇脫色10 min，檢測(cè)脫色液在570 nm的吸光度 (A值)。計(jì)算抑菌率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

XTT法檢測(cè)厚樸煎煮液對(duì)白念珠菌黏附作用的影響 分組處理同上，37℃培養(yǎng)24 h后，XTT法檢測(cè)450 nm的吸光度 (A值)。計(jì)算抑菌率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按以下公式計(jì)算抑菌率：抑菌率=(陰性對(duì)照孔A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/(陰性對(duì)照孔A值-空白對(duì)照孔A值)×100%[6]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)晶紫法觀察不同濃度厚樸煎煮液抗白念珠菌黏附作用

結(jié)果顯示厚樸煎煮液對(duì)白念珠菌的黏附具有抑制作用，同一黏附時(shí)間內(nèi)其抑制作用隨藥物濃度的升高而增強(qiáng)，抑制作用具有濃度依賴性。隨著菌黏附時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率也有相應(yīng)升高。同一黏附時(shí)間內(nèi)，除菌液處理1 h組15.63 mg/L和7.81 mg/L兩個(gè)濃度組外，其余各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。見表1。

2.2 XTT法觀察不同濃度厚樸煎煮液抗白念珠菌黏附作用

結(jié)果顯示：厚樸煎煮液對(duì)白念珠菌的黏附具有抑制作用，同一黏附時(shí)間內(nèi)其作用具有一定的濃度依賴性，菌液處理1 h各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。隨著黏附時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率有減弱趨勢(shì)，見表2。

組別濃度(mg/L)1h2h3hA值抑制率(%)A值抑制率(%)A值抑制率(%)陰性對(duì)照組01.46±0.04-1.49±0.03-1.72±0.04-厚樸煎煮液組125.001.38±0.04*5.721.36±0.05*8.431.48±0.04*14.0162.501.40±0.03*4.021.37±0.05*7.851.48±0.05*13.8831.251.41±0.03*3.421.38±0.05*7.421.49±0.06*13.4815.631.41±0.053.711.38±0.04*7.291.50±0.05*12.677.811.46±0.020.191.44±0.05*3.411.55±0.03*9.88

注：*.與陰性對(duì)照組比較，P<0.05

組別濃度(mg/L)1h2h3hA值抑制率(%)A值抑制率(%)A值抑制率(%)陰性對(duì)照組00.38±0.04-0.35±0.06-0.45±0.05-厚樸煎煮液組125.000.23±0.03*39.920.31±0.0511.510.35±0.06*21.8462.500.23±0.04*38.800.31±0.0512.610.4±0.0610.0631.250.25±0.05*34.620.31±0.0711.340.4±0.0611.6815.630.28±0.04*27.370.32±0.078.450.42±0.056.637.810.29±0.04*24.470.33±0.046.040.44±0.032.73

注：*.與陰性對(duì)照組比較，P<0.05

3 討 論

中藥厚樸為木蘭科木蘭屬植物厚樸或凹葉厚樸的干燥干皮、根皮及枝皮?，F(xiàn)代藥理試驗(yàn)證明厚樸具有廣譜抗菌、抗腫瘤、抗炎、保護(hù)心腦血管、抗?jié)円约翱鼓茸饔肹7]。田玉珠等[8]研究發(fā)現(xiàn)厚樸活性成分和厚樸酚對(duì)體外白念珠菌黏附及其生物膜的形成及厚度均有抑制作用。中藥煎劑是我國應(yīng)用最早最廣泛的中藥劑型[9]，厚樸煎煮液采用煎煮法獲得，其中含有厚樸酚及和厚樸酚等活性成分，具有抗白念珠菌的作用。本文旨在采用結(jié)晶紫和XTT兩種方法比較厚樸煎煮液對(duì)白念珠菌的黏附有無抑制作用及兩種方法檢測(cè)有無差別。結(jié)晶紫是一種堿性染料，能與帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面分子和胞外基質(zhì)中多聚糖結(jié)合，活菌、死菌和基質(zhì)均可被染色[10]。XTT即甲基四氮鹽，是一種黃色水溶性物質(zhì)，它可在線粒體脫氫酶的作用下降解為棕色的四氮鹽-甲臜，反應(yīng)過程中顏色變化能反映出存活細(xì)胞數(shù)量，并可通過分光光度計(jì)定量測(cè)定，以光密度值反映白念珠菌生物膜細(xì)胞生長(zhǎng)活力[11]。本研究發(fā)現(xiàn)兩種方法均測(cè)出厚樸煎煮液對(duì)白念珠菌黏附具有抑制作用。結(jié)晶紫法中隨著菌液黏附時(shí)間的延長(zhǎng)，厚樸煎煮液對(duì)白念珠菌抑制率升高。分析其原因可能是由于結(jié)晶紫染色法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果受到很多因素的影響，如結(jié)晶紫濃度、染色時(shí)間、洗滌時(shí)間等，同時(shí)結(jié)晶紫染色法不能區(qū)分活菌、死菌，基質(zhì)也能被染色[12]。而XTT法中產(chǎn)生的四氮鹽-甲臜可溶于水，顏色變化反映的是活菌的數(shù)量。XTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)厚樸煎煮液對(duì)白念珠菌黏附1 h的抑制率最高，隨著菌液黏附時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用減弱，其原因可能是由于黏附時(shí)間延長(zhǎng)有利于白念珠菌生物膜的形成，進(jìn)而對(duì)藥物的抗性也增強(qiáng)了。而在125 mg/mL濃度3 h組的抑制率高于2 h組，可能是由于人為操作的誤差，具體原因有待進(jìn)一步驗(yàn)證。就本實(shí)驗(yàn)的目的而言，XTT法能更確切地檢測(cè)厚樸煎煮液對(duì)白念珠菌的黏附抑制作用。

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[本文編輯] 王 飛

貴州省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃 (201413653016)

周艷萌，女 (漢族)，碩士，副教授.E-mail:307879470@qq.com

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1673-3827(2017)12-0159-03

2016-12-06