周艷萌 向曉波 馮琳穎 董華

(1.遵義醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)實驗室；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔外科；3.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與科技學(xué)院2011級；4.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與科技學(xué)院2012級，遵義 563003)

·技術(shù)與方法·

兩種檢測方法評價厚樸對白念珠菌黏附的影響

周艷萌1向曉波2馮琳穎3董華4

(1.遵義醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)實驗室；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔外科；3.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與科技學(xué)院2011級；4.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與科技學(xué)院2012級，遵義 563003)

XTT法；結(jié)晶紫法；白念珠菌；黏附

白念珠菌是人體常見的機會致病性真菌，可存在于正常人口腔、上呼吸道、腸道及陰道，易在義齒、人工插管如尿道插管、氣管插管等植入性設(shè)備表面定植并進一步形成生物膜。生物膜的形成可保護菌體免受藥物的殺傷和免疫系統(tǒng)的攻擊。黏附是生物膜成膜的關(guān)鍵，也是白念珠菌致病的關(guān)鍵步驟[1]。本實驗擬通過結(jié)晶紫法與XTT法觀察中藥厚樸對白念珠菌黏附的影響，并對兩種檢測方法進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料

白念珠菌 (ATCC 10231)由遵義醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)實驗室提供。厚樸購于遵義市芝林大藥房。RPMI1640培養(yǎng)基 (GIBCO公司),YPD液體培養(yǎng)基依據(jù)文獻配制[2]，1%結(jié)晶紫染液 (結(jié)晶紫粉末2 g,溶于20 mL無水乙醇。草酸銨0.8 g，溶于80 mL蒸餾水。將兩者充分混勻過濾備用)[3]，XTT/PMS應(yīng)用液按照試劑盒說明書配置。二甲基亞砜 (DMSO)(天津市光復(fù)精細化工研究所，分析純)。

1.2 方法

白念珠菌先在沙氏瓊脂培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，然后接種于YPD液體培養(yǎng)基。

厚樸煎煮液的制備 厚樸為烤干的生藥，按戴自英[4]提供的方法制備生藥濃度為1 g/mL的水煎液,濾器過濾除菌后，用RPMI1640培養(yǎng)液按二倍稀釋法將厚樸煎煮液稀釋成以下濃度:125、62.5、31.3、15.6和7.8 μg/mL。

結(jié)晶紫法檢測厚樸煎煮液對白念珠菌黏附作用的影響 濃度為1×106cells/mL的菌液接種于96孔板中，每孔100 μL菌液，37℃分別培養(yǎng)1 h、2 h和3 h后，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗去未黏附菌[5]，每孔加入上述各濃度藥液100 μL，每組8個復(fù)孔，同時設(shè)陰性對照孔 (含菌液培養(yǎng)基)及空白對照孔，37℃培養(yǎng)24 h，每孔加入1%的結(jié)晶紫染液150 μL染20 min后，PBS洗3次，每孔加入150 μL 95%乙醇脫色10 min，檢測脫色液在570 nm的吸光度 (A值)。計算抑菌率。每組實驗重復(fù)3次。

XTT法檢測厚樸煎煮液對白念珠菌黏附作用的影響 分組處理同上，37℃培養(yǎng)24 h后，XTT法檢測450 nm的吸光度 (A值)。計算抑菌率。每組實驗重復(fù)3次。按以下公式計算抑菌率：抑菌率=(陰性對照孔A值-實驗組A值)/(陰性對照孔A值-空白對照孔A值)×100%[6]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)晶紫法觀察不同濃度厚樸煎煮液抗白念珠菌黏附作用

結(jié)果顯示厚樸煎煮液對白念珠菌的黏附具有抑制作用，同一黏附時間內(nèi)其抑制作用隨藥物濃度的升高而增強，抑制作用具有濃度依賴性。隨著菌黏附時間的延長，抑制率也有相應(yīng)升高。同一黏附時間內(nèi)，除菌液處理1 h組15.63 mg/L和7.81 mg/L兩個濃度組外，其余各實驗組與陰性對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。見表1。

2.2 XTT法觀察不同濃度厚樸煎煮液抗白念珠菌黏附作用

結(jié)果顯示：厚樸煎煮液對白念珠菌的黏附具有抑制作用，同一黏附時間內(nèi)其作用具有一定的濃度依賴性，菌液處理1 h各實驗組與陰性對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。隨著黏附時間的延長，抑制率有減弱趨勢，見表2。

組別濃度(mg/L)1h2h3hA值抑制率(%)A值抑制率(%)A值抑制率(%)陰性對照組01.46±0.04-1.49±0.03-1.72±0.04-厚樸煎煮液組125.001.38±0.04*5.721.36±0.05*8.431.48±0.04*14.0162.501.40±0.03*4.021.37±0.05*7.851.48±0.05*13.8831.251.41±0.03*3.421.38±0.05*7.421.49±0.06*13.4815.631.41±0.053.711.38±0.04*7.291.50±0.05*12.677.811.46±0.020.191.44±0.05*3.411.55±0.03*9.88

注：*.與陰性對照組比較，P<0.05

組別濃度(mg/L)1h2h3hA值抑制率(%)A值抑制率(%)A值抑制率(%)陰性對照組00.38±0.04-0.35±0.06-0.45±0.05-厚樸煎煮液組125.000.23±0.03*39.920.31±0.0511.510.35±0.06*21.8462.500.23±0.04*38.800.31±0.0512.610.4±0.0610.0631.250.25±0.05*34.620.31±0.0711.340.4±0.0611.6815.630.28±0.04*27.370.32±0.078.450.42±0.056.637.810.29±0.04*24.470.33±0.046.040.44±0.032.73

注：*.與陰性對照組比較，P<0.05

3 討 論

中藥厚樸為木蘭科木蘭屬植物厚樸或凹葉厚樸的干燥干皮、根皮及枝皮?，F(xiàn)代藥理試驗證明厚樸具有廣譜抗菌、抗腫瘤、抗炎、保護心腦血管、抗?jié)円约翱鼓茸饔肹7]。田玉珠等[8]研究發(fā)現(xiàn)厚樸活性成分和厚樸酚對體外白念珠菌黏附及其生物膜的形成及厚度均有抑制作用。中藥煎劑是我國應(yīng)用最早最廣泛的中藥劑型[9]，厚樸煎煮液采用煎煮法獲得，其中含有厚樸酚及和厚樸酚等活性成分，具有抗白念珠菌的作用。本文旨在采用結(jié)晶紫和XTT兩種方法比較厚樸煎煮液對白念珠菌的黏附有無抑制作用及兩種方法檢測有無差別。結(jié)晶紫是一種堿性染料，能與帶負電荷的細胞表面分子和胞外基質(zhì)中多聚糖結(jié)合，活菌、死菌和基質(zhì)均可被染色[10]。XTT即甲基四氮鹽，是一種黃色水溶性物質(zhì)，它可在線粒體脫氫酶的作用下降解為棕色的四氮鹽-甲臜，反應(yīng)過程中顏色變化能反映出存活細胞數(shù)量，并可通過分光光度計定量測定，以光密度值反映白念珠菌生物膜細胞生長活力[11]。本研究發(fā)現(xiàn)兩種方法均測出厚樸煎煮液對白念珠菌黏附具有抑制作用。結(jié)晶紫法中隨著菌液黏附時間的延長，厚樸煎煮液對白念珠菌抑制率升高。分析其原因可能是由于結(jié)晶紫染色法的實驗結(jié)果受到很多因素的影響，如結(jié)晶紫濃度、染色時間、洗滌時間等，同時結(jié)晶紫染色法不能區(qū)分活菌、死菌，基質(zhì)也能被染色[12]。而XTT法中產(chǎn)生的四氮鹽-甲臜可溶于水，顏色變化反映的是活菌的數(shù)量。XTT法檢測發(fā)現(xiàn)厚樸煎煮液對白念珠菌黏附1 h的抑制率最高，隨著菌液黏附時間的延長，抑制作用減弱，其原因可能是由于黏附時間延長有利于白念珠菌生物膜的形成，進而對藥物的抗性也增強了。而在125 mg/mL濃度3 h組的抑制率高于2 h組，可能是由于人為操作的誤差，具體原因有待進一步驗證。就本實驗的目的而言，XTT法能更確切地檢測厚樸煎煮液對白念珠菌的黏附抑制作用。

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[本文編輯] 王 飛

貴州省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃 (201413653016)

周艷萌，女 (漢族)，碩士，副教授.E-mail:307879470@qq.com

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1673-3827(2017)12-0159-03

2016-12-06