劉開菊，陳勇剛

（1.重慶市江北區(qū)中醫(yī)院，重慶 400020； 2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，重慶 400010）

高效液相色譜法測(cè)定天眩四物湯中天麻素含量

劉開菊1，陳勇剛2

（1.重慶市江北區(qū)中醫(yī)院，重慶 400020； 2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，重慶 400010）

目的建立測(cè)定天眩四物湯中天麻素含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法采用高效液相色譜法，色譜柱為伊利特 Hypersil ODS2－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m）；流動(dòng)相為乙腈（A）－0.1%磷酸（B）梯度洗脫，0～13.5 min，A為1.9%，14～23 min，A為40%；流速為1 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；柱溫為25℃；理論板數(shù)按天麻素峰計(jì)算應(yīng)不低于1 500。結(jié)果天麻素質(zhì)量濃度在 0.116～1.160 g／L范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好，平均回收率為100.00%，RSD＝1.54%（n＝6）。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)，可為制訂天眩四物湯質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和有效控制天眩四物湯的內(nèi)在質(zhì)量提供技術(shù)參考。

天眩四物湯；天麻素；高效液相色譜法；含量測(cè)定

天眩四物湯為下川東名老中醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)方，為四物湯和半夏白術(shù)天麻湯通過加減化裁而來，由赤芍、熟地黃、當(dāng)歸、川芎、天麻、白術(shù)、茯苓、竹茹、丹參、甘草等組方，對(duì)治療頸椎病眩暈癥具有很好的療效。為探討其內(nèi)在質(zhì)量，確保臨床療效穩(wěn)定可靠，本研究中采用高效液相色譜法測(cè)定天麻素的含量[1－4]，為進(jìn)一步制成醫(yī)院制劑提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津 LC－20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Mettler Toledo AG135十萬分之一天平。

1.2 試藥

天麻素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110807－200205）；樣品（自制）；磷酸、甲醇為分析純；乙腈為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：伊利特 Hypersil ODS2－C18柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相：乙腈（A）－0.1%磷酸（B）梯度洗脫，0～13.5 min時(shí)A為1.9%，14～23 min時(shí)A為40%；流速：1 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；柱溫：25℃。理論板數(shù)按天麻素峰計(jì)算應(yīng)不低于1 500。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：稱取經(jīng)干燥至恒重的天麻素標(biāo)準(zhǔn)品5.8 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容至刻度，制成每1 mL含0.058 mg的天麻素對(duì)照品溶液。

供試品溶液：將樣品搖勻，精密吸取1 mL，加50%甲醇定容至50 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：將不含天麻的天眩四物湯陰性樣品搖勻，精密吸取1 mL，加50%甲醇定容至50 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：稱取經(jīng)減壓干燥至恒重的對(duì)照品天麻素5.8 mg，精密稱定，用甲醇定容至100 mL容量瓶中，配成58 μg／mL的對(duì)照品貯備液，吸取貯備液，稀釋成質(zhì)量濃度為5.8，11.6，23.2，34.8，46.4 μg／mL的對(duì)照品溶液。按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y＝1 632 208 X－7 841.85，r＝0.999 7（n＝6）。結(jié)果表明，天麻素質(zhì)量濃度在0.116～1.160μg范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：取同一天麻素對(duì)照品溶液（每1 mL含天麻素58 μg），重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果峰面積的 RSD為1.00%（n＝5），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取本品（批號(hào)為20160420）適量，精密吸取1 mL，加50%甲醇定容至50 mL，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得供試品溶液，重復(fù)制備5份，按擬訂色譜條件依法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的 RSD為1.60%（n＝5），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20160420）樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件，分別于0，1，2，4，6，8 h時(shí)各進(jìn)樣 20 μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為1.20%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：分別精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)為20160420，含天麻素0.683 mg／mL）1 mL，置100 mL容量瓶中，共6份，各精密加入天麻素對(duì)照品溶液（每1 mL含0.005 8 mg）1 mL，加50%甲醇定容至刻度，按樣品含量測(cè)定方法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 天麻素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.4 樣品含量測(cè)定

精密量取不同批次的樣品各1 mL，依法制備供試品溶液，并按擬訂方法進(jìn)樣測(cè)定天麻素含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（g／L）

3 討論

天眩四物湯為治痰瘀致眩之劑，方中天麻平肝熄風(fēng)而止頭眩，為君藥；赤芍和血通絡(luò)，當(dāng)歸、熟地黃活血養(yǎng)血，治頭暈?zāi)垦?，川芎藥性上行頭目以活血祛瘀，白術(shù)、茯苓健脾燥濕，與天麻配伍共增化痰止眩之功，共為臣藥；竹茹祛痰，以竹之脈絡(luò)通人之脈絡(luò)，丹參活血通絡(luò)祛瘀，共為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥共用以達(dá)化痰祛瘀止眩、養(yǎng)血通絡(luò)的功效。研究表明，該合劑具有明顯的活血養(yǎng)血、祛痰化瘀、通絡(luò)止眩作用。為了更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本研究中選擇君藥天麻作為含量測(cè)定指標(biāo)。

選擇天眩四物湯處方中天麻有效成分天麻素作為控制產(chǎn)品的指標(biāo)成分，并進(jìn)行了方法學(xué)研究[5－9]。研究結(jié)果表明，陰性無干擾，目標(biāo)色譜峰與相鄰峰達(dá)到基線分離，通過試驗(yàn)確定了線性范圍，考察了精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率等。結(jié)果表明，所建立的方法符合定量分析的要求。

通過驗(yàn)證試驗(yàn)表明，用高效液相色譜法測(cè)定樣品中的天麻素含量，結(jié)果準(zhǔn)確，方法可行。通過對(duì)3個(gè)批次的含量測(cè)定結(jié)果表明，制劑中天麻素平均含量為0.660 g／L，根據(jù)通用含量限度確定方法（±15%）確定本品的含量限度不得低于0.56 g／L。

本研究中對(duì)處方中的臣藥赤芍[10－13]、熟地黃[14]、當(dāng)歸[15]、川芎[16]等藥品所含的主要化學(xué)成分亦進(jìn)行了初步的含量測(cè)定研究，但重復(fù)性欠佳。應(yīng)進(jìn)一步對(duì)處方中所含臣藥及其他藥物所含成分進(jìn)行測(cè)試，為制訂天眩四物湯質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，開發(fā)成具有重慶地方特色的醫(yī)院制劑提供技術(shù)支撐。

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Content Determination of Gastrodine in Tianxuan Siwu Decoction by HPLC

Liu Kaiju1，Chen Yonggang2
(1.Jiangbei District Hospital of Traditional Chinese Medicine，Chongqing，China 400020； 2.Children’s Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing，China 400010）

Objective To establish an HPLC method for the content determination of gastrodine in Tianxuan Siwu Decoction.M ethods The HPLC method was used.The chromatographic column was the Ealet Hypersil ODS2－C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）；acetonitrile（A） － 0.1% phosphoric acid（B）was used as the mobile phase，gradient elution，0－13.5 min，A 1.9%，14－23 min，A 40%，the flow rate was 1 mL／min；the detection the wavelength is 220 nm，the column temperature was 25℃.The number of theoretical plates according to the calculation of the peak of the peak should not be less than 1 500.Results The gastrodin concentrationwas linear in the range of 0.116－1.160 μg／L，the average recovery rate was 100.00%，RSD＝1.54%（n＝6）.Conclusion The method is simple，rapid，reproducible and specific，can provide technical reference for the formulation of internal quality standards and Tianxuan Siwu Decoction.

Tianxuan Siwu Decoction；gastrodine；HPLC；content determination

R284.1；R286.0

A

1006－4931(2016)24－0072－03

2016－08－11；

2016－09－15)