黃 軍，靳 磊，魏小武，羅容珺，程 偉，單世平，郭照輝

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

一株高耐鎘菌株的分離、鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

黃 軍，靳 磊，魏小武，羅容珺，程 偉，單世平，郭照輝

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

采用梯度濃度馴化方法，從極度重金屬污染環(huán)境的土壤中取樣分離、純化1株具有較強(qiáng)鎘耐受性的菌株（編號為LY29-1-5）。經(jīng)菌落、菌體形態(tài)觀察、生理生化及系統(tǒng)發(fā)育分析，該菌株初步鑒定為大腸桿菌（Escherichia coli）。該菌株能耐受鎘離子的最高濃度為15 mmol/L，在最低抑制濃度試驗(yàn)中，該菌株對鉛、銅、鋅也表現(xiàn)出了一定的耐受性。

梯度濃度馴化；鎘抗性菌株；系統(tǒng)發(fā)育分析；大腸桿菌；抑制濃度

微生物是土壤中最活躍的生命因子，可通過多種方式降低土壤重金屬的生物有效性和可遷移性，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中承擔(dān)著重要的生態(tài)功能。鑒于傳統(tǒng)鎘污染土壤修復(fù)方法的不足，利用土壤微生物原位修復(fù)重金屬污染成為研究的熱點(diǎn)?？赏ㄟ^向污染土壤中添加鎘吸附性微生物，利用這些微生物的表面活性基團(tuán)對重金屬進(jìn)行胞外沉淀、絡(luò)合、胞內(nèi)積累和氧化還原等作用，降低土壤中重金屬鎘的活性及農(nóng)產(chǎn)品中的鎘含量[1-9]。試驗(yàn)從嚴(yán)重鎘污染土壤中取樣，分離純化了1株具有較強(qiáng)鎘抗性的菌株，并通過形態(tài)觀察、生理生化及系統(tǒng)發(fā)育分析，研究了該菌株對鎘和其他重金屬的耐受性，旨在為探索開發(fā)更多高效、實(shí)用的土壤原位微生物鈍化產(chǎn)品和生物吸附劑產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 耐鎘細(xì)菌菌株的分離和純化

在湖南省重金屬污染嚴(yán)重的土壤中，采用常規(guī)方法采集土壤樣品5份，用于鎘高固定微生物的分離、篩選。

耐鎘細(xì)菌菌株按照以下步驟分離和純化：（1）將10 g土壤加入到裝有90 mL無菌水（含吐溫-80）的三角瓶中，搖床振蕩30 min，靜止20 min；（2）用裝有4.5 mL無菌水的試管梯度稀釋10-5～10-2；（3）按2 mmol/L終濃度將鎘溶液加入LB培養(yǎng)基中，制備平板；（4）平板冷卻后，每個梯度取200 μL土壤浸出液涂布于平板上，重復(fù)3次；（5）待平板將液體完全吸收后，30℃恒溫培養(yǎng)；（6）培養(yǎng)2～3 d后，挑取形態(tài)差異大、生長良好的菌落在含鎘平板上劃線純化，將挑取劃線培養(yǎng)的單菌落移入試管斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 耐鎘細(xì)菌鎘抗性馴化篩選

將細(xì)菌菌株活化，用接種環(huán)分區(qū)劃線于含2 mmol/L鎘的LB平板上，28～30℃恒溫箱中培養(yǎng)3～5 d后，將生長良好的細(xì)菌轉(zhuǎn)接到4 mmol/L鎘的LB平板上，在后續(xù)培養(yǎng)中，依次遞增鎘平板濃度，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。

1.3 菌株LY29-1-5的菌落、菌體形態(tài)觀察

在固體培養(yǎng)基上觀察LY29-1-5的菌落形態(tài)，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行菌體形態(tài)觀察。

1.4 菌株LY29-1-5的生理生化分析

葡萄糖、麥芽糖、甘露醇等糖醇類的氧化發(fā)酵試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)及硫化氫試驗(yàn)的具體方法均參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（第9版）和文獻(xiàn)[10]。

1.5 菌株LY29-1-5的鑒定

1.5.1形態(tài)鑒定將純化的細(xì)菌劃線接種于LB培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)72 h，觀察菌落形態(tài)、大小、顏色、表面及邊緣等特征。

1.5.2分子鑒定提取DNA后，對16S rDNA目的片斷進(jìn)行PCR擴(kuò)增[11]。引物序列：F，5'-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3'；R，5'-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3'。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：去離子水39 μL，PCR buffer 5 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物各l μL，基因組DNA 1 μL，DNA聚合酶1 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性50 s，54℃退火30 s，72℃延伸90 s，29個循環(huán)。72℃終末延伸10 min。PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定。使用MEGA5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 菌株對多種重金屬的抗性試驗(yàn)

菌株活化后分別加入相應(yīng)濃度（15、10、8、6、0.1和0.09 mmol/L）的6種重金屬（Cd2+、Zn2+、Pb2+、Cu2+、Hg2+、Ag+）溶液（分別由CdCl2、Zn(NO3)2、Pb(NO3)2、CuCl2、HgCl2和AgNO3配制），約24 h后取出，用比色法測定各重金屬菌液的OD600值。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鎘菌株的梯度分離和馴化結(jié)果

用含2 mmol/L鎘細(xì)菌培養(yǎng)基平板，分離到了150個細(xì)菌菌株，經(jīng)過馴化篩選到的LY29-1-5菌株，在15 mmol/L的鎘平板上能生長（圖1）。

圖1 菌株LY29-1-5的菌落形態(tài)

2.2 細(xì)菌LY29-1-5的革蘭氏染色、形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1形態(tài)特征菌株LY29-1-5在LB培養(yǎng)基上28℃下培養(yǎng)48 h后，菌落形態(tài)規(guī)則，濕潤，不透明，粉紅色。菌體桿狀，最適生長溫度26～30℃，革蘭氏染色為陰性。

2.2.2生理生化特性生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果：吲哚實(shí)驗(yàn)和甲基紅實(shí)驗(yàn)為陽性；V-P實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)硫化氫實(shí)驗(yàn)為陰性；可利用葡萄糖、麥芽糖和甘露醇等碳源。

2.3 細(xì)菌LY29-1-5的16S rDNA序列分析

由圖2可知，可測定LY29-1-5菌株的16S rDNA序列全長為1 452 bp。將經(jīng)測序得到的序列進(jìn)行Blast序列分析，LY29-1-5與大腸桿菌（Escherichia coli strain H1）的16S rDNA序列同源性達(dá)96%。

圖2 細(xì)菌LY29-1-5的16S rDNA PCR結(jié)果

2.4 細(xì)菌LY29-1-5的系統(tǒng)發(fā)育分析

隨機(jī)選取同源性較高的11株細(xì)菌的16S rDNA序列，與菌株LY29-1-5的16S rDNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖3可知，菌株LY29-1-5與大腸桿菌（Escherichia coli strain H1）具有較近的同源性?；谠摼甑木w和菌落形態(tài)、生理生化分析，該菌株初步鑒定為大腸桿菌。

圖3 細(xì)菌LY29-1-5的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 菌株LY29-1-5的多金屬抗性分析

多金屬抗性分析結(jié)果表明，該菌株對Hg2+和Ag+比較敏感，微量的Hg2+和Ag+存在時，該菌株的生長基本受到抑制；該菌株對Cd2+和Zn2+抗性較強(qiáng)，對Pb2+和Cu2+次之（圖4）。因此該菌株具有抗多種重金屬的能力，這為菌株在復(fù)雜的土壤環(huán)境中的生存和繁殖提供條件。

圖4 細(xì)菌LY29-1-5對6種重金屬的最低抑菌濃度

3 結(jié)論與討論

研究從湖南省極度重金屬污染的土壤中利用高通量篩選技術(shù)分離、純化到1株重金屬鎘高耐性菌株LY29-1-5，該菌株經(jīng)菌體、菌落形態(tài)觀察、分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析，初步確定為大腸桿菌。經(jīng)多種重金屬的抗性分析發(fā)現(xiàn)，該菌株對多種重金屬特別是土壤污染中常見重金屬Cd2+、Zn2+、Pb2+等均表現(xiàn)出不同程度的抗性水平。

近年來，隨著重金屬對土壤環(huán)境的污染加劇，其治理技術(shù)措施也面臨巨大的挑戰(zhàn)。在具體的實(shí)施過程中，不同的方法具有不同的優(yōu)缺點(diǎn)。微生物體積小、比表面積大、繁殖速度快、代謝旺盛、種類多、容易培養(yǎng)、對環(huán)境有很強(qiáng)的適應(yīng)性，是人類最寶貴的資源庫。隨著污染物的不斷累積，微生物的種類和代謝類型呈現(xiàn)出多樣性，微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理遺傳優(yōu)勢使它們在污染物的降解轉(zhuǎn)化、生態(tài)環(huán)境保護(hù)等方面具有巨大的潛力。因此，研究微生物資源的開發(fā)利用，探索開發(fā)更多高效、實(shí)用的土壤原位微生物鈍化產(chǎn)品和生物吸附劑產(chǎn)品用于去除重金屬具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會意義。

[1] 王慧萍. 耐鋅細(xì)菌的篩選、抗鋅特性及其對苯酚的降解研究[D].上海：東華大學(xué)，2011.

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（責(zé)任編輯：夏亞男）

Isolation, Identification and Phylogenetic Analysis of a High Cd-resistance Bacterial Strain

HUANG Jun，JIN Lei，WEI Xiao-wu，LUO Rong-jun，CHENG Wei，SHAN Shi-ping，GUO Zhao-hui
（Hunan Academy of Microbiology, Changsha 410009, PRC）

A high Cd-resistance strain (No. LY29-1-5) was isolated and purified from extremely heavy metal contaminated soil by acclimation of concentration gradient approach. The strain was identifed as Escherichia coli by morphological examination, physiological and biochemical characteristics as well as 16S rDNA sequence and phylogenetic analysis. The strain could endure 15 mmol/L maximum concentration of cadmium (Cd2+). The strain was also proved to have the ability to resist Pb2+, Cu2+, Zn2+through experiment of minimum inhibitory concentration (MIC).

acclimation of concentration gradient; Cd2+resistance strain; phylogenetic analysis; Escherichia coli; inhibitory concentration

book=15,ebook=23

X53

A

1006-060X（2016）12-0015-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.012.005

2016-09-01

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（13JJ2035）；農(nóng)業(yè)部、財(cái)政部“長株潭”耕地重金屬污染修復(fù)及農(nóng)作物種植結(jié)構(gòu)調(diào)整子項(xiàng)目（農(nóng)辦財(cái)函[2016]6號）

黃 軍（1977-），女，湖南岳陽市人，助理研究員，主要從事農(nóng)業(yè)微生物和農(nóng)田重金屬污染修復(fù)治理等方面的研究。

郭照輝