張 竹

高效液相色譜法測定阿奇霉素片含量的不確定度分析

張 竹

目的為了驗證測量值的準(zhǔn)確性，對高效液相色譜（HPLC）法測定阿奇霉素片含量的不確定度進(jìn)行分析。方法 通過建立HPLC法測定含量的數(shù)學(xué)模型，并根據(jù)《測量不確定度評定與表示技術(shù)規(guī)范》（JJF1059.1-2012）中有關(guān)規(guī)定評估其不確定度。結(jié)果分析不確定度影響因素，得出測量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度和置信區(qū)間。結(jié)論建立的不確定度評估方法適用于片劑類不確定度的分析。

阿奇霉素；不確定度；含量；高效液相色譜法

阿奇霉素片在《中國藥典》2010年版二部[1]含量的檢測方法由微生物效價測定更改為高效液相色譜（HPLC）法，更改幅度較大。為確保藥品檢驗的準(zhǔn)確性，保障人民用藥的安全性，本研究對HPLC法測定阿奇霉素片含量的不確定度進(jìn)行分析，找出各環(huán)節(jié)對不確定度的影響因素，最終建立適用HPLC法測定阿奇霉素片含量的不確定度方法，消除在實驗過程中可能帶來的誤差，以提高測定數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可信性。

1 儀器與試藥

安捷倫液相色譜儀（1100，HPLC），紫外檢測器，生產(chǎn)企業(yè)：美國安捷倫公司。梅特勒XA205電子天平；梅特勒S210型酸度計；生產(chǎn)企業(yè)：瑞士梅特勒-托利多儀器上海有限公司。供試品：阿奇霉素片，生產(chǎn)企業(yè)：山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司，批號：130801，規(guī)格：0.25 g。阿奇霉素對照品：中國藥物檢驗制品研究院提供，批號：130593-201002，純度：94.3%。

2 實驗方法

2.1 對照品溶液的制備精密稱取阿奇霉素對照品25 mg，用乙腈定容于25 ml量瓶中，制成1 mg/ml的對照品溶液，備用。

2.2 供試品溶液的制備取供試品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取粉末適量（約相當(dāng)于阿奇霉素250 mg），用乙腈定容于250 ml量瓶中，制成1 mg/ml的供試品溶液，搖勻，濾過，備用。

2.3 色譜條件WondaCractODS-2 C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），流動相為磷酸鹽緩沖液（取0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液，用20%的磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至8.2）-乙腈（45:55），體積流量為1.0 ml/min，檢測波長為210 nm，進(jìn)樣量為50 μl，柱溫為30 ℃。

2.4 測定方法分別精密量取對照品溶液、供試品溶液各50 μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算。

3 結(jié)果分析

3.1 數(shù)學(xué)模型根據(jù)《中國藥典》2010版二部規(guī)定，含量計算公式：

式中X：阿奇霉素片的百分標(biāo)示含量（%），At：供試品峰面積，Ws：對照品稱樣量（g），Vs：對照品定容體積，Ps：對照品純度，M：平均片重（g），As：對照品峰面積，Wt：供試品稱樣量（g），Vt：供試品定容體積，C標(biāo)：供試品標(biāo)示量（g），rep：重復(fù)性。

3.2 不確定度來源分析

表1 引起不確定度的因素

3.3 各分量不確定度的評定

3.3.1 樣品稱量過程引入的不確定度u（m1）（B類不確定度）

3.3.1.1 樣品的均勻性本實驗依照J(rèn)TF1135-2005《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[2]規(guī)定，將樣品研磨后充分混勻隨機(jī)取樣，可認(rèn)為樣品是均勻的，代表性充分，由此所致的不確定度可忽略不計。

3.3.1.2 樣品稱量①天平校準(zhǔn)不確定度（B類不確定度）：根據(jù)檢定證書，分析天平的置信區(qū)間為±0.1 mg，按矩形分布，取包含因子K=3，則由此帶來的不確定度分量值為：u1（m1）=0.1 mg/3=0.057 80 mg。

②稱量重復(fù)性的不確定度（B類不確定度）：根據(jù)檢定證書，未考慮樣品或?qū)φ掌诽匦詫Y(jié)果的影響，重復(fù)性誤差為±0.2 mg，按矩形分布，取包含因子K=3，則由此帶來的不確定度分量值為：u2（m1）= 0.2 mg/3=0.1156 mg。

ua（m1）=uc（m1）/A=0.1828 mg/298.9 mg=6.116×10-4

ub（m1）=uc（m1）/B=0.1828 mg/297.7 mg=6.140×10-4

取供試品20片，精密稱定，求得平均片重為0.2990g/片，每片重量x1=0.2984、0.3005、0.2992、0.2988、0.2991、0.2984、0.2996、0.2983、0.2988、0.2991、0.2975、0.3012、0.2989、0.2981、0.2995、0.2986、0.2991、0.2972、0.3003、0.2994 g。

片重差異的標(biāo)準(zhǔn)不確定度[3]按貝塞爾公式計算：

片重差異引起的相對不確定度：

供試品質(zhì)量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.3.2 容量儀器校準(zhǔn)引入的不確定度u（V25）u（V250）容量允差JJG196-2006規(guī)定[4]，20 ℃時25 ml容量瓶的A級容量允差為±0.03 ml，250 ml容量瓶的容量瓶允差為±0.15 ml。取三角形分布，則由此帶來的不確定度分量為B類不確定度：

25 ml容量瓶標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

250 ml容量瓶標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

校準(zhǔn)容量瓶環(huán)境溫度所帶來的不確定度為B類不確定度，根據(jù)公式Δv=（V×水的膨脹系數(shù)× ΔT=2.1×10-4×3，3 ℃差異），按矩形分布評定：

25 ml容量瓶帶來的合成不確定度為：

兩份對照品分別定容于兩個25 ml容量瓶中，則對照品定容相對不確定度為：

urel（V25）=2u（V25）/V25=2×0.015 26/25= 1.221×10-3

250 ml容量瓶帶來的合成不確定度為：

兩份供試品分別定容于兩個250 ml容量瓶中，則供試品定容相對不確定度：

3.3.3 供試品色譜峰面積的不確定度u（A1）（A類不確定度）含量測定時供試品溶液平行進(jìn)樣4針，

記錄峰面積A為6695.375 73、6725.781 74，平均值6710.58 ，極差為30.41，取n=2時的極差系數(shù)C=1.13，用極差法計算[5-6]其標(biāo)準(zhǔn)不確定度相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urelA（A1）=4.021×10-3，B為6622.333 37、6645.866 21，平均值為6634.10，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urelB（A1）=3.139×10-3。

供試品峰面積的相對不確定度：

3.3.4 對照品稱量過程引入的不確定度u（m2）（B類不確定度）精密稱取阿奇霉素對照品A為0.026 33g、B為0.026 73g，同3.3.1.2項則由天平稱量帶來的相對不確定度：

阿奇霉素對照品純度為94.3%，純度標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.7%，按矩形分布，取包含因子K=，對照品純度的相對不確定度為：

對照品質(zhì)量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.3.5 對照品色譜峰面積的不確定度u（A2）（A類不確定度）對照品溶液A重復(fù)進(jìn)樣5次，峰面積分別為6696.325 20、6709.389 28、6695.922 49、6686.120 48、6667.521 97，平均值為6691.06，RSD%= 0.23%，對照品溶液峰面積測量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

對照品溶液B，進(jìn)樣2針峰面積分別為6819.931 76、6804.307 37，平均值為6812.12，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：urelB（A1）=2.030×10-3，對照品峰面積的相對不確定度：

3.3.6 高效液相色譜儀測量帶來的不確定度u（s）（B類不確定度）高效液相色譜儀測量帶來的不確定度是由質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督管理局檢定校準(zhǔn)得出來的，檢定證書（編號：YH171301168）給出的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：urel（s）=0.002

3.3.7 結(jié)果重復(fù)性的不確定度u（rep）（B類不確定度）該測量重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差是本測量所有隨機(jī)影響的合成[7]，因此其他不確定度來源中的隨機(jī)分量不再考慮。取本品重復(fù)測量6次，測量值分別為99.51%、99.07%、98.61%、98.76%、99.36%、98.21%，平均值為98.9%。單次測量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u（rep）= 4.932×10-3，在日常檢驗中，測定兩份樣品報告平均值，故平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

平均值的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表2 各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分布情況

3.4 合成不確定度

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：urel（x）= u（x）×x=0.989 ×0.008 231=0.008 140

3.5 擴(kuò)展不確定度U=K urel（x）=0.81%×2=1.6%（k=2），含量測定結(jié)果可表示為：X=（98.9±1.6）%（k=2，置信概率95%）

4 討論

由表2可以看出，儀器帶來的誤差是不容忽視的，重復(fù)進(jìn)樣的過程中峰面積每針引入的不確定度對最后的結(jié)果影響較大。高效液相色譜儀本身對測定結(jié)果的影響因素就很多[8]，難以一一評估，在藥品分析檢測中，應(yīng)盡量規(guī)范化操作，減少不必要的稀釋步驟，嚴(yán)格控制實驗條件。在稱量過程中要嚴(yán)格控制一人操作，避免多人操作帶來的人為誤差，稱量環(huán)境的濕度控制也應(yīng)符合要求。在合成總不確定度中，明顯發(fā)現(xiàn)對阿奇霉素含量測定準(zhǔn)確度的影響比較大的還有標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程，故在日常工作中可以通過適當(dāng)加大對照品稱樣量，選擇A級的玻璃容器來減少不確定度對結(jié)果的影響，從而更好地控制藥物分析的測量結(jié)果。

[1] 中華人民共和國藥典委員會.中國藥典(二部)[S].北京,2010:153.

[2] 韓永志.化學(xué)測量不確定度的估計和表示[J].化工標(biāo)準(zhǔn)計量質(zhì)量,2001(1):32-34.

[3] 王玉,潘晞陵.藥品檢測中的片劑重量差異不確定度估算[J].藥物分析雜志,2005,25(6):706.

[4] 中華人民共和國藥國家技術(shù)監(jiān)督管理局.中華人民共和國國家計量規(guī)程·常用玻璃量器(JJG196-2006)[S].北京,2006.

[5] 中華人民共和國藥國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.測量不確定度的評定與表示(JJF1059-2012)[S].北京,2012.

[6] 中國實驗室國家認(rèn)可委員會.實驗室認(rèn)可與管理基礎(chǔ)知識[M].北京:中國計量出版社,2003.

[7] 王洪家,馬蘭,賈志剛.注射用頭孢曲松鈉含量測定的不確定度分析[J].天津藥學(xué),2010,22(1):24-26.

[8] 陸明,范國榮,汪楊,等.測量不確定度在藥品檢測領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J].中國藥事,2013,27(5):485-492.

HPLC method for determination of the uncertainty of azithromycin piece of content analysis

Zhang Zhu

Objective In order to verify the accuracy of the measured values, the uncertainty of HPLC method for determination of azithromycin piece of content analysis.MethodsBy establishing the mathematical model of the HPLC method for determination of content,and according to the measurement uncertainty evaluation and technical specification for said(JJF1059.1-2012)of the relevant provisions of the evaluate the uncertainty.ResultThe analysis of influencing factors of uncertainty,the expanded uncertainty of the measurement results and the confidence interval.ConclusionThe method to estimate the uncertainty of applicable to the tablet class of uncertainty analysis.

Azithromycin;Uncertainty;Content;HPLC

R927.2

A【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.12.005

長春市食品藥品檢驗中心,遼寧長春 130012

張竹（1984-），本科學(xué)歷，主管藥師。研究方向：藥物分析。E-mail：qijiouruola@sohu.com