蔡恬靜 劉青杰*

[文章編號] 1672-8270(2017)05-0141-03 [中圖分類號] R-33 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A

胞質(zhì)分裂阻滯法分析細(xì)胞組學(xué)研究指標(biāo)在公共衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀*

蔡恬靜①劉青杰①*

[文章編號] 1672-8270(2017)05-0141-03 [中圖分類號] R-33 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A

近年來利用胞質(zhì)分裂阻滯法分析微核、核質(zhì)橋、核芽、核分裂指數(shù)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死等細(xì)胞組學(xué)指標(biāo)，成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域探討不同人群結(jié)構(gòu)、環(huán)境、職業(yè)暴露等因素對基因組不穩(wěn)定性、染色體斷裂、丟失和細(xì)胞增殖能力的影響的常用方法?，F(xiàn)將利用胞質(zhì)分裂阻滯法分析多種細(xì)胞組學(xué)指標(biāo)在公共衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀做以綜述。

胞質(zhì)分裂阻滯法；微核，核質(zhì)橋；核芽；核分裂指數(shù)；細(xì)胞組學(xué)指標(biāo)

[First-author’s address]National Institute for Radiological Protection, Key Laboratory, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100088, China.

細(xì)胞組學(xué)研究是致力于確定單細(xì)胞分子表型，進(jìn)而研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)及分子功能的科學(xué)；是根據(jù)細(xì)胞不同的分子表型來探索疾病分子機制的策略；也是連接基因組、蛋白質(zhì)組和組織功能的橋梁。

近年來，應(yīng)用淋巴細(xì)胞胞質(zhì)分裂阻滯法檢測外周血淋巴細(xì)胞中微核、核芽及核質(zhì)橋的發(fā)生頻率和分布特點以及核分裂指數(shù)等，成為分析造成DNA損傷和錯誤修復(fù)、染色體不穩(wěn)定性、有絲分裂異常、細(xì)胞死亡和生長抑制的內(nèi)因(性別、年齡及種族等)或外因(環(huán)境因素、職業(yè)暴露及疾病等)的重要手段[1-2]。

1 微核、核芽和核質(zhì)橋的相關(guān)性

微核(micronucleus，MN)形成是染色體損傷或全染色體丟失的生物標(biāo)志物，是細(xì)胞受遺傳毒物作用后的一種遺傳學(xué)終點。核芽(nuclear buds，NBUD)是細(xì)胞去除放大的或多余的DNA的機制，是基因放大、擴(kuò)增或基因劑量改變的生物標(biāo)志。核質(zhì)橋(nucleoplasmic bridge，NPB)是細(xì)胞染色體受到損傷后，發(fā)生染色體斷裂一融合一橋循環(huán)(breakage—fusion—bridge，BFB)而形成的，DNA雙鏈斷裂發(fā)生后，雙鏈斷裂的兩條姐妹染色單體的末端發(fā)生融合，形成雙著絲粒染色體，在細(xì)胞分裂后期，由于2個著絲粒彼此移向細(xì)胞的兩極而形成細(xì)胞核之間的橋狀連接。NPB的另一個形成機制是由于端?？s短或缺少端粒結(jié)合蛋白所致的端粒末端融合。MN、NBUD和NPB三者的形成機制雖不相同，但大量研究表明三者之間具有較強的相關(guān)性，都是基因毒性和染色體不穩(wěn)定的生物標(biāo)志物[3]。

2 核分裂指數(shù)的影響

核分裂指數(shù)(nuclear division index，NDI)反映了細(xì)胞核分裂的能力和增殖狀況。核分裂指數(shù)越高，表明細(xì)胞增殖能力越強，用來評估外源化合物對細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和毒性的影響。近年來，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死也被納入了胞質(zhì)分裂阻滯法細(xì)胞組學(xué)的檢測范圍，三者的聯(lián)合使用能為外源性有害物質(zhì)的毒性檢測提供細(xì)胞生長抑制和細(xì)胞毒性的相關(guān)信息。

3 細(xì)胞組學(xué)研究在公共衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀

近年來，由于人們生活習(xí)慣(吸煙、飲酒及營養(yǎng)攝入等)、環(huán)境因素及職業(yè)暴露(化工材料、加工廢料及農(nóng)藥等)引起的疾病問題，成為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域關(guān)注的問題[4]。以胞質(zhì)分裂阻滯法為主要檢測手段的細(xì)胞組學(xué)研究方法對染色體變異和損傷標(biāo)志物的研究，為各種因素給機體造成的損傷提供了細(xì)胞遺傳學(xué)和細(xì)胞毒性方面的依據(jù)。

3.1 人群結(jié)構(gòu)、分布及生活習(xí)慣等因素的影響

評估人群細(xì)胞遺傳本底水平的變異度和明確影響細(xì)胞損傷的內(nèi)、外因素，通過監(jiān)測群體數(shù)據(jù)評估一般人群中細(xì)胞遺傳學(xué)損傷的正常水平對于檢測已知職業(yè)危險因素或潛在的遺傳毒性物質(zhì)暴露是必要的。

Verica等[5-6]研究表明，正常人群中年齡、性別及吸煙三種因素對微核發(fā)生頻率的影響無顯著性差異，但NDI在年齡、性別及吸煙三種因素水平上有顯著性差異(P=0.00015)。大量的職業(yè)暴露和環(huán)境因素影響的生物監(jiān)測研究都把吸煙作為混雜因素來研究，即煙草雖然含有大量的致癌物質(zhì)，但其與MN發(fā)生頻率的相關(guān)性還存在爭議，歐洲的部分實驗室也得到了相對一致的結(jié)果，對其可能的原因分析如下：①重度吸煙者(≥30支/d)缺乏葉酸和維生素B12的攝入，二者參與MN的形成[6-7]；②煙草暴露可以導(dǎo)致體內(nèi)MN的產(chǎn)生，但應(yīng)用胞質(zhì)分裂阻滯法進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)時，存在MN的淋巴細(xì)胞不能接受刺激分裂為雙核細(xì)胞，因此未納入計數(shù)的范圍；③被煙草損傷的細(xì)胞不能夠進(jìn)行分裂，狀態(tài)類似壞死或凋亡的細(xì)胞[8-9]。相關(guān)研究結(jié)果提示，在進(jìn)行群體研究時吸煙與否的亞組分析可以忽略，值得關(guān)注的是日吸煙量＞30支亞組的分析結(jié)果。

3.2 環(huán)境因素和職業(yè)暴露因素的影響

目前，利用胞質(zhì)分裂阻滯法分析人群生活、工作環(huán)境中存在的可能導(dǎo)致的染色體損傷和細(xì)胞學(xué)改變的遺傳學(xué)致病因素和細(xì)胞毒素，已經(jīng)成為評估多種職業(yè)危險因素與環(huán)境因素暴露的重要手段。

在某些職業(yè)暴露(柴油機尾氣、鉛及農(nóng)藥等)的研究中，MN、NBUD和NPB發(fā)生頻率均顯著高于未暴露組，且NDI顯著性降低，表明某些職業(yè)暴露可導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性和染色體損傷，并可抑制外周血淋巴細(xì)胞的分裂增殖能力，引起基因組不穩(wěn)定性增高。相關(guān)研究還表明，隨著農(nóng)藥暴露水平的增加，細(xì)胞壞死率有增高趨勢，而凋亡細(xì)胞則未發(fā)現(xiàn)明顯的變化趨勢，但兩者較對照組皆具有顯著性差異，原因可能是農(nóng)藥高劑量暴露后干擾細(xì)胞進(jìn)入凋亡途徑，抑制細(xì)胞的凋亡，同時使細(xì)胞急性壞死率增加[10，13-14]。并且在電離輻射職業(yè)暴露研究結(jié)果與染色體畸變分析的結(jié)果一致，提示MN、NBUD和NPB可以作為低水平電離輻射致染色體損傷的早期標(biāo)志物[15-16]。

另有針對于苯職業(yè)暴露的研究，研究手段和分析方法較復(fù)雜。Jamebozorg等[17]、Lovreglio等[18]和Basso等[19]分別用胞質(zhì)分裂阻滯法分析了苯暴露的石油工人外周血淋巴細(xì)胞中MN、NBUD和NPB的發(fā)生頻率。前兩者的結(jié)論一致：即暴露組的MN、NBUD和NPB的發(fā)生頻率明顯高于對照組，但無統(tǒng)計學(xué)差異。然而，Singaraju等[20]同樣采用胞質(zhì)分裂阻滯法在暴露組工人的口腔脫落細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)MN的顯著性升高。Singaraju的研究結(jié)果與上述結(jié)果相矛盾，可能的原因為：①黏膜的脫落細(xì)胞直接接觸苯等有害物質(zhì)，對于細(xì)胞損傷有直接的反應(yīng)；②化學(xué)毒性物質(zhì)誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞基因組損傷可經(jīng)外周血循環(huán)滲透向下到達(dá)基底層，發(fā)揮其基因破壞效應(yīng)，產(chǎn)生核分裂以及MN、NBUD和NPB等核異常情況；③組織間其固有的解毒和DNA修復(fù)能力的差異。

4 結(jié)語

細(xì)胞組學(xué)利用胞質(zhì)分裂阻滯法在外周血淋巴細(xì)胞中的應(yīng)用為體內(nèi)和體外研究遺傳毒性和細(xì)胞毒性提供了標(biāo)準(zhǔn)化的方法，可廣泛應(yīng)用于區(qū)域性的人群和暴露因素調(diào)查。由于受到年齡、性別、吸煙、飲酒、藥物以及放化療等因素較大影響，單因素分析與多因素分析可能存在矛盾的結(jié)論，在某些醫(yī)學(xué)評價方面有一定的局限性。在后續(xù)的研究中可以詳細(xì)分析不同因素對于MN、NBUD和NPB以及NDI等的影響，并將明確的因素納入研究對象的篩選原則，從而減少混雜因素對統(tǒng)計結(jié)果的影響。隨著公共衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，以胞質(zhì)分裂阻滯法分析研究細(xì)胞組學(xué)多重指標(biāo)的手段，已經(jīng)在環(huán)境、職業(yè)暴露，某些疾病及腫瘤等相關(guān)領(lǐng)域提供重要的遺傳學(xué)依據(jù)，相信在不久的將來會成為更為活躍的前沿研究領(lǐng)域。

[1]Fenech M.Cytokinesis-block micronucleus assay evolves into a“cytome”assay of chromosomal instability，mitotic dysfunction and cell death[J]. Mutat Res，2006，600(112)：58-66.

[2]Fenech M，Morley AA.Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay[J]. Cytobios，1985，43(172-173)：233.

[3]Fenech M.Cytokinesis—block micronucleus assay evolves into a“cytome”assay of chromosomal instability，mitotic dysfunction and cell death[J].Mutat Res，2006，600(112)：58-66.

[4]鄭玉新.公共衛(wèi)生、環(huán)境衛(wèi)生與職業(yè)衛(wèi)生領(lǐng)域研究進(jìn)展[J].科學(xué)觀察，2015，10(5)：39-43.

[5]Garaj-Vrhovac V，Durinec M，Kopjar N，et al. A survey on the cytogenetic status of the Croatian general population by use of the cytokinesis-block micronucleus assay[J].Mutat Res，2008，649(1-2)：91-100.

[6]Bonassi S，Neri M，Lando C，et al.Effect of smoking habit on the frequency of micronuclei in human lymphocytes：results from the Human MicroNucleus project[J].Mutat Res，2003，543(2)：155-166.

[7]Hagmar L，Bonassi S，Str?mberg U，et al. Cancer predictive value of cytogenetic markers used in occupational health surrveilance programs：a report from an ongoing study by the European Study Group on Cytogenetic Biomakers and Health[J].Mutat Res，1998，405(2)：171-178.

[8]Kirsch-Volders M，Sofuni T，Aardema M，et al. Report from the in vitro micronucleus assay working group[J].Mutat Res，2003，540：153-163.

[9]Fenech M，Holland N，Chang WP，et al.The Human MicroNucleus Project-an international collaborative study on the use of micronucleus technique for measuring DNA damage in humans[J].Mutat Res，1999，428(1-2)：271-283.

[10]肖新華，高峰，李園園，等.柴油機尾氣對職業(yè)人群外周血淋巴細(xì)胞增殖能力和基因組穩(wěn)定性的影響[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2015，49(3)：228-232.

[11]Minozzo R，Deimling LI，Gigante LP，et a1. Micronuclei in peripheral blood lymphocytes of workers exposed to lead[J].Mutat Res，2004，565(1)：53-60.

[12]翟慶峰，趙健，邢杰，等.溫室作業(yè)人員農(nóng)藥暴露致外周血淋巴細(xì)胞基因組不穩(wěn)定表型[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2015，32(11)：1051-1053.

[13]Pastor S，Creus A，Parron T，et al.Biomonitoring of four European populations occupationally exposed to pesticides：use of micronuclei as biomarkers[J].Mutagenesis，2003，18(3)：249-258.

[14]Galluzzi L，Vitale I，Abrams JM，et al.Molecular definitions of cell death subroutines：recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012[J].Cell Death Differ，2012，19(1)：107-120.

[15]Caradonna F.Nucleoplasmic bridges and acrocentric chromosome associations as early markers of exposure to low levels of ionising radiation in occupationally exposed hospital workers[J].Mutagenesis，2015，30(2)：269-275.

[16]董小梅，王治，張國偉，等.低劑量工業(yè)射線探傷工人職業(yè)暴露的遺傳損傷效應(yīng)[J].癌變·畸變·突變，2015，27(2)：101-105.

[17]Jamebozorgi I，Mahjoubi F，Pouryaghoub G，et al. Micronucleus，nucleoplasmic bridge，and nuclear budding in peripheral blood cells of workers exposed to low level benzene[J].Int J Occup Environ Med，2016，7(4)：227-233.

[18]Lovreglio P，Maffei F，Carrieri M，et al.Evaluation of chromosome aberration and micronucleus frequencies in blood lymphocytes of workers exposed to low concentrations of benzene[J].Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen，2014，770：55-60.

[19]Basso E，Cevoli C，Papacchini M，et al.Cytogenetic biomonitoring on a group of petroleum refinery workers[J].Environ Mol Mutagen，2011，52(6)：440-447.

[20]Singaraju M，Singaraju S，Parwani R，et al. Cytogenetic biomonitoring in petrol station attendants：A micronucleus study[J].J Cytol，2012，29(1)：1-5.

The application of cytokinesis-block method to analyze cytomics indicators in public health field/CAI Tian-jing, LIU Qing-jie//China Medical Equipment,2017,14(5):141-143.

In recent years, cytokinesis-block method was used to analyze cytomics indicators including micronucleus, nuclear bridge, nuclear bud, nuclear division index, cell apoptosis and cell necrosis. In public health, it has become the common method to explore the impacts of different population structure, environment and occupational exposure for genomic instability, chromosome breakage, chromosome loss and cell proliferation. This article reviews and discusses the application of using cytokinesis block method to analyze cytomics indicators in public health field.

Cytokinesis-block method; Micronucleus; Nuclear bridge; Nuclear bud; Nuclear division index; Cytomics indicator

蔡恬靜,女,(1979- ),本科學(xué)歷，助理研究員。中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所 中國疾病預(yù)防控制中心重點實驗室，研究方向：輻射生物效應(yīng)。

2017-02-20

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.05.038

國家自然科學(xué)基金(81573081)“人外周血淋巴細(xì)胞核質(zhì)橋作為快速輻射生物劑量計的研究”

①中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所 中國疾病預(yù)防控制中心重點實驗室 北京 100088

*通訊作者：qjliu@nirp.cn