高澤鑫，何臘平，2*，劉亞兵，高冰，李翠芹，劉涵玉

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州大學(xué)貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025；3.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢430068；4.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院貴州，貴陽550025）

納豆激酶的研究進(jìn)展與展望

高澤鑫1，何臘平1，2*，劉亞兵1，高冰3，李翠芹4，劉涵玉1

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州大學(xué)貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025；3.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢430068；4.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院貴州，貴陽550025）

納豆激酶主要是由枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）代謝產(chǎn)生的堿性絲氨酸蛋白酶，因其具有較強(qiáng)的溶栓能力而著稱。與其他的大多溶栓劑相比，納豆激酶具有安全性好、成本低、易吸收、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，因此可用于開發(fā)溶栓藥物。該文對(duì)國內(nèi)外納豆激酶的溶栓功效、理化特性、發(fā)酵工藝、活性測定、純化、改性和產(chǎn)品進(jìn)行了綜述，對(duì)其當(dāng)前研究中的關(guān)鍵問題進(jìn)行分析，并對(duì)未來納豆激酶的研究方向進(jìn)行了展望。

納豆激酶；溶栓；理化特性；純化；改性

納豆起源于中國的秦漢時(shí)期，是傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，在唐朝時(shí)期由高僧鑒真東渡時(shí)傳入日本，根據(jù)日本的風(fēng)土漸漸演變?yōu)榧{豆，它被認(rèn)為是日本人長壽的“秘方”，食用歷史1 000年以上[1]。納豆類似中國的發(fā)酵豆和豆豉，經(jīng)枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）發(fā)酵而來，日本將納豆作為調(diào)味品和營養(yǎng)食品[2]，而國人主要將豆豉作為調(diào)味料食用。日本學(xué)者SUM IH等[3]于1987年首次對(duì)納豆及其提取物作了系統(tǒng)研究，最初將酶的提取物添加到纖維蛋白平板上，發(fā)現(xiàn)有明顯的溶栓作用，并確定其屬于具有纖溶活性的激酶。

血栓疾病嚴(yán)重影響著人類的健康，全球每年因患血栓類疾病死亡的人數(shù)多達(dá)1 200萬，中國約有260萬[4]，因此溶栓藥物的開發(fā)成為了研究的熱點(diǎn)。目前臨床上常見的溶栓藥物是鏈激酶（streptokinase，SK）、尿激酶（urokinase，UK）和組織型纖溶酶原激活劑（tissue-typeplasminogenactivator，t-PA），由于以上藥物存在給藥痛苦、副作用大、售價(jià)較貴、半衰期短的缺點(diǎn)，開發(fā)替代藥物成為了新的研究方向。具有高效溶栓作用的納豆激酶（nattokinase，NK）受到了廣泛的關(guān)注[5]，它可以降低纖維蛋白原、促進(jìn)催化血纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)化為血纖維蛋白溶酶、增加體內(nèi)血栓溶解因子的合成的作用[6]。同時(shí)由于納豆激酶具有可口服、安全性高、價(jià)格低和纖溶活力強(qiáng)等優(yōu)勢，其開發(fā)研究成為近年來溶栓類產(chǎn)品的研究熱點(diǎn)[7]，目前國內(nèi)外研究在納豆激酶的理化特性及基因工程方面都取得了較大的進(jìn)展。本文綜述了國內(nèi)外關(guān)于納豆激酶的溶栓功效、理化特性、發(fā)酵工藝、活性測定、純化、改性和產(chǎn)品的相關(guān)研究，對(duì)當(dāng)前研究中的一些問題進(jìn)行分析，并對(duì)未來納豆激酶的研究方向進(jìn)行了展望。

1 納豆激酶的研究進(jìn)展

1.1 溶栓功效

通過大鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[9]，靜脈注射納豆激酶的溶血栓活性是血纖維蛋白原溶酶的4倍[8]。經(jīng)健康人群口服和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)可知，服用納豆激酶后，血液中的優(yōu)球蛋白溶解加快，纖維蛋白降解產(chǎn)物增加。體內(nèi)溶栓的實(shí)驗(yàn)顯示，納豆激酶能夠有效減緩血栓的形成，顯著減少股動(dòng)脈的長度及濕質(zhì)量并有效提高血栓的再通率，顯著減少肺內(nèi)血栓的形成。因此，納豆激酶擁有較強(qiáng)的體內(nèi)溶栓作用，且溶栓作用明顯高于同等劑量的尿激酶[10]。

據(jù)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，納豆激酶能間接的將血纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)化為血纖維蛋白溶酶，促使纖維蛋白凝塊水解，但納豆激酶沒有血纖維蛋白溶酶原激活劑的功能，不能直接將血纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)化為血纖維蛋白溶酶，這一點(diǎn)不同于組織型纖溶酶原激活劑、尿激酶、鏈激酶[11]。納豆激酶能使纖溶酶原激活物抑制劑（plasm inogenadivatorinhibitor，PAI）失活，而PAI具有抑制組織纖維蛋白溶酶原激活劑的作用，可見納豆激酶是通過蛋白水解作用直接溶解纖維蛋白凝塊的[12]。

1.2 理化特性

納豆激酶是枯草芽孢桿菌代謝時(shí)產(chǎn)生的一種堿性絲氨酸蛋白酶，為單鏈多肽結(jié)構(gòu)，無二硫鍵，溶于水，固態(tài)呈淡黃色或白色。納豆激酶的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）序列由275個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其相對(duì)分子質(zhì)量一般為28 000 u。該酶N末端為丙氨酸，等電點(diǎn)pH為（8.6±0.3）[13]。在室溫下，該酶在pH值6.0～12.0的范圍內(nèi)具有很強(qiáng)的纖維蛋白水解能力，最適pH值為8，在酸性條件下會(huì)迅速失活。納豆激酶酶活不易受反復(fù)凍融影響，溫度達(dá)50℃以上時(shí)酶活性會(huì)逐漸喪失，超過60℃酶迅速失活，其最適溫度為45℃。此外金屬離子也會(huì)影響其活性，Hg2+能使它完全失活，Mn2+、Zn2+、Co2+、Cu2+和Mg2+等對(duì)其酶活也有抑制作用，而Ca2+和Mg2+對(duì)酶活有明顯的激活作用[14]。

1.3 活性測定研究

納豆激酶是一種具有溶栓活性的蛋白酶，其活性測定原理依據(jù)于纖維蛋白原溶解系統(tǒng)的生理過程。主要檢測方法有：瓊脂糖-纖維蛋白原平板法、纖維蛋白原塊溶解時(shí)間法、四肽底物法[15]、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbentassay，ELISA）和血清平板法等檢測方法，其中使用較為普遍的為瓊脂糖-纖維蛋白原平板法及纖維蛋白原塊溶解時(shí)間法[16]。

瓊脂糖-纖維蛋白原平板法操作方便、觀察簡便、成本低、可同時(shí)測多個(gè)樣品，應(yīng)用較為普遍，但其測定值易隨培養(yǎng)時(shí)間、平板厚度的變化而變化，精確度較差；纖維蛋白原塊溶解時(shí)間法適用于粗酶活力的測定，對(duì)測定靈敏度要求較高的樣品誤差較大，同時(shí)不便于多個(gè)樣品的同時(shí)測定；四肽底物法雖操作簡單，但不能完全的反應(yīng)酶活[17]；血清平板法雖能方便快速的同時(shí)用于多個(gè)樣品測定，但吸光度值會(huì)受人工血栓制備的影響誤差較大；ELISA準(zhǔn)確性和特異性較高，但操作繁瑣、成本較高[18]。

2 納豆激酶的發(fā)酵工藝

納豆激酶是微生物代謝產(chǎn)物，只要工程菌活性穩(wěn)定，工藝成熟即可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。由于NK發(fā)酵原料來源廣、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、價(jià)格低廉和易于提取純化等優(yōu)勢，使其開發(fā)前景廣闊[19]。與液體發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵成本低、酶活力高、酶系豐富、設(shè)備操作簡單、易于企業(yè)擴(kuò)大化生產(chǎn)且產(chǎn)率高[20]，因此，國內(nèi)外食品發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)普遍采用這種工藝[21]。發(fā)酵后的產(chǎn)品不僅可用作食品直接食用，還可以通過進(jìn)一步的分離純化，制得不同級(jí)別的納豆激酶產(chǎn)品—納豆膠囊和納豆激酶膠囊。目前商業(yè)化發(fā)酵中采用的納豆激酶，活性為800～4 000 IU/g。納豆激酶發(fā)酵基質(zhì)以含水量在50%～70%之間的黃豆為主[22]。此外可通過添加麥芽糖及少量的無機(jī)鹽，促進(jìn)納豆激酶的合成，提高納豆激酶的含量，或以農(nóng)副產(chǎn)品為原料降低發(fā)酵的成本[23]。

納豆激酶擁有現(xiàn)在市場上的一些溶栓藥物所無法比擬的優(yōu)勢，因此專家學(xué)者期望利用它開發(fā)為新一代的溶栓劑。國內(nèi)外有關(guān)篩選產(chǎn)納豆激酶菌株酶活力的報(bào)道多數(shù)為100～3 000 IU/g，少部分較高納豆激酶酶活力的報(bào)道為3 000～5 000 IU/m L[24-27]。就目前納豆激酶酶活力不足的研究現(xiàn)狀，提高納豆激酶酶活力對(duì)開發(fā)新型溶栓藥物非常關(guān)鍵。提升納豆激酶產(chǎn)量常用的方法有：對(duì)野生菌種進(jìn)行大量篩選或誘變，以期得到產(chǎn)酶量高的菌種；優(yōu)化發(fā)酵條件，包括對(duì)發(fā)酵原料和發(fā)酵因素的優(yōu)化；利用基因工程技術(shù)，改造菌種的基因，得到產(chǎn)酶量高的菌種。

3 納豆激酶的純化

目前純化納豆激酶常用的方法有：鹽析、超濾、層析過濾以及凝膠過濾。其中王剛等[28]將發(fā)酵液通過硫酸銨沉淀和Sephadex G-50凝膠過濾層析進(jìn)行分離純化，得到酶比活力、純化倍數(shù)、酶活回收率分別為22 388.81U/mg、19倍和42.1%的高純度納豆激酶。李睿等[29]采用硫酸銨沉淀和Phenyl Sepharose疏水柱層析分離純化納豆激酶NKⅡ粗酶液，得到酶活回收率、純化倍數(shù)、比活力分別為56.51%、17.90倍和48 407.77 IU/mg的高純度納豆激酶。CHOID B等[30]通過采用硫酸銨沉淀、超濾濃縮和陰離子交換層析的方法對(duì)冬蟲夏草中的粗酶進(jìn)行分離純化，得到純化倍數(shù)高達(dá)86.1倍，回收率為13.7%的納豆激酶。這些研究大都存在著方法繁瑣、回收率較低、不利于保持酶活力和規(guī)?；a(chǎn)等問題。隨著現(xiàn)代分離技術(shù)的發(fā)展，分離技術(shù)在發(fā)酵產(chǎn)品分離純化中應(yīng)用日漸廣泛，把新型分離技術(shù)應(yīng)用于納豆激酶的分離純化，對(duì)科學(xué)研究及生產(chǎn)意義重大。如LIU JG等[31]首次報(bào)道了使用AOT/異辛烷反膠束從發(fā)酵液中提取納豆激酶，并得到了純化倍數(shù)2.7倍、酶活回收率80%的酶液。3相分配法（threephasepartitioning，TPP）是一種高效的生物分離技術(shù)，GARGR等[32]采用該種方法，利用硫酸銨和叔丁醇的組合從粗提取物中沉淀蛋白質(zhì)，得到了純化倍數(shù)5.6倍，酶活回收率為129.5%的酶液。

4 納豆激酶的穩(wěn)定性與改性

由于納豆激酶屬于大分子化合物，所以在保藏過程中容易失活，因而需要找到更好地維持其酶活穩(wěn)定性的方法。眾所周知苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）和異丙氟磷（diisopropyl fluorophosphate，DIFP）對(duì)絲氨酸蛋白酶具有強(qiáng)烈的抑制作用[5]。JAOUADIB等[33]研究發(fā)現(xiàn)常見的抑制劑如苯丙胺酰氯甲酮（technological pedagogicalcontentknow ledge，TPCK）、對(duì)甲苯磺酰賴氨酸氯甲基酮（toluene sulfonyl lysine ketone，TLCK）、胰凝乳蛋白酶烷化劑、苯甲脒和抑肽酶等均未對(duì)絲氨酸蛋白酶有明顯的抑制效果。碘乙酰胺、亮抑酶肽、二硫代蘇糖醇和胃酶抑素A等試劑同樣對(duì)酶活性幾乎沒有影響。

由于多數(shù)納豆激酶藥物以口服方式，因此要維持其在消化系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，主要需從物理包埋和分子改性上實(shí)現(xiàn)。DONG X Y等[34]利用植物甾醇、卵磷脂和甘露醇等為輔料通過正交試驗(yàn)找到最佳的配比，實(shí)現(xiàn)封裝效率達(dá)65.25%并完成了對(duì)納豆激酶的有效包埋。在納豆激酶中加入蛋白胨、甘油、海藻酸鈉和明膠等同樣可幫助維持酶活力，并提高其熱穩(wěn)定性或加入煮沸過的小麥提取液、肉湯以及血清蛋白等，可使納豆激酶在酸性條件下仍能保持一定的酶活[35]。這表明通過化學(xué)方法改性也能使NK在胃環(huán)境下保持一定的活力，因此可以通過口服達(dá)到應(yīng)有的溶栓效果。常見的納豆激酶改性一般是建立在對(duì)功能基因探究和酶分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上。WENGM Z等[36]通過定點(diǎn)誘變構(gòu)建的單突變體L31I是野生型NK的2倍催化效率，而雙突變體T220S/I31L和M 222A/I31L的酶活性有顯著增加，其中突變體M 222A/I31L相對(duì)于野生型NK的氧化穩(wěn)定性有顯著增強(qiáng)。

5 納豆激酶類產(chǎn)品

5.1 納豆激酶藥品

現(xiàn)在溶栓藥物大多為纖溶酶原激活劑（plasminogen activator，PA）或其類似物，可直接或間接激活纖溶酶原（plasminogen，Pg）變成纖溶酶（plasm in，Pm），從而促進(jìn)機(jī)體血栓的溶解。由溶血栓藥物的發(fā)展歷程，可將其分為四代[37]：第一代以UK和SK為代表，溶血栓效果好，但會(huì)出現(xiàn)系統(tǒng)性出血及過敏反應(yīng)[38]；第二代藥物以tPA、葡激酶（straphylokinase，SaK）和NK為代表，與血栓基質(zhì)有特異親和力，但是半衰期長，單療程用量較大；第三代藥物以瑞替普酶（reteplase，rPA）、蘭替普酶（lanoteplase，NPA）、靶向溶栓劑等為代表，對(duì)溶栓效率、特異性等進(jìn)行了進(jìn)一步的提升；第四代藥物主要是纖溶酶原激活劑抑制劑-1（plasm inogen activator inhibitor-1，PAI-1），通過增加血漿中tPA的濃度，促進(jìn)溶栓活性，且可口服、價(jià)格較低。目前由于多種原因的限制，國內(nèi)臨床用藥仍以UK和SK為主，根據(jù)當(dāng)前情況，在第三、四代藥物產(chǎn)品還在緩慢進(jìn)行的時(shí)候，更應(yīng)該務(wù)實(shí)的對(duì)第二代藥物，尤其是納豆激酶產(chǎn)品的深入開發(fā)。因納豆激酶穩(wěn)定性易受胃酸影響，令酶活力降低，所以應(yīng)研發(fā)抗酸性更強(qiáng)的腸溶型制劑藥物。

5.2 納豆激酶保健品

目前，納豆激酶類保健品主要可分為膠囊劑和片劑兩種，還有個(gè)別的顆粒劑。已有10余家大公司生產(chǎn)納豆激酶類保健品，其中日本生物科研所最早將納豆激酶投入商業(yè)化生產(chǎn)，美國、韓國、臺(tái)灣地區(qū)相繼也有大量的納豆激酶生產(chǎn)廠家。在國家食品藥品監(jiān)督進(jìn)口保健食品數(shù)據(jù)庫中，并未查到任何國外納豆激酶類保健食品的批準(zhǔn)文號(hào)。因此，國外的納豆激酶類保健食品數(shù)年內(nèi)還不能進(jìn)入中國市場，對(duì)國內(nèi)產(chǎn)品暫時(shí)不會(huì)構(gòu)成威脅。這也顯示出了國內(nèi)對(duì)NK沒有形成完善、統(tǒng)一、嚴(yán)格的納豆激酶類保健食品成分標(biāo)準(zhǔn)，缺乏明確的功能指標(biāo)和感覺評(píng)價(jià)體系。其次，國內(nèi)納豆激酶保健品多以黃豆為主要原料，功能過于單一、發(fā)酵活性較低，不利于高活性產(chǎn)品的制備。

5.3 功能性食品

納豆作為一種與納豆激酶相關(guān)的功能性食品，與現(xiàn)有的臨床溶栓藥物相比具有許多優(yōu)點(diǎn)，如安全性好、成本低、療效久和有效預(yù)防血栓產(chǎn)生[39]。納豆含有大豆的各種營養(yǎng)成分，且營養(yǎng)物質(zhì)的含量均高于蒸煮的大豆。在其制作中，微生物酶系將大豆蛋白質(zhì)分解為氨基酸和多肽，蛋白質(zhì)的消化率由65%提高至80%，更有利于吸收[40]。此外，納豆還具有抗菌、抗腫瘤、防治骨質(zhì)疏松、溶解血栓等功能[41]。據(jù)統(tǒng)計(jì)約90%的日本人將新鮮納豆作為日常必需食品，還將其列入中小學(xué)生營養(yǎng)配餐。在我國，鮮納豆由于其令人不愉快的臭味不易被消費(fèi)者接受，這大大阻礙了通過飲食攝入納豆激酶，降低血栓發(fā)病率的措施。因此需開發(fā)適合國內(nèi)消費(fèi)者口味的納豆產(chǎn)品，目前通過從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離出產(chǎn)納豆激酶生產(chǎn)菌株，或者將納豆食品膠囊化來掩蓋納豆的臭味，來解納豆口感不適問題[42]。在原有納豆食品的研究基礎(chǔ)上，許多科研人員也將納豆激酶運(yùn)用到其他的食品中，如UPADHYAY V K等[43]將納豆激酶作為外源性水解蛋白酶去促進(jìn)奶酪中的原發(fā)性蛋白水解，此過程不僅增加了大部分游離氨基酸的含量，而且這些氨基酸能用作許多分解代謝反應(yīng)的底物，反過來又改善了奶酪的風(fēng)味。

6 展望

本文概括了國內(nèi)外關(guān)于納豆激酶的綜合研究，發(fā)現(xiàn)納豆激酶的溶栓抗栓效果和理化特性都有了系統(tǒng)性的研究，并開發(fā)了多種納豆激酶類產(chǎn)品。近年來通過對(duì)納豆激酶菌種的篩選和發(fā)酵工藝的改進(jìn)，提高了納豆激酶的產(chǎn)量。在工業(yè)化生產(chǎn)中，優(yōu)化了納豆激酶、口服納豆凍干粉、納豆激酶膠囊的分離純化工藝，豐富和改良了納豆產(chǎn)品的保健功效；改善了納豆原有的氨臭味，使其適用中國人的口感。在菌株選育方面，利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)和誘變育種技術(shù)，選育可供大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)良菌株，提高了產(chǎn)量。納豆激酶的許多良好的生理調(diào)節(jié)功能及開發(fā)特性，使其受到越來越多的關(guān)注，為預(yù)防血管栓塞性疾病，解決大多溶栓藥物口服性差、價(jià)格昂貴、并發(fā)癥多等問題帶來的福音，前景十分廣闊。

[1]高瑞萍，劉輝，劉嘉，等.納豆的研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵科技，2011，47（1）：23-26.

[2]YOSHIKAWA Y,CHEN PY,ZHANGB,etal.Evaluation of seed chemicalquality traitsand sensory propertiesofnatto soybean[J].Food Chem, 2014,153(153):186-192.

[3]SUM IH,HAMADA H,TSUSHIMA H,et al.A novel fibrinolytic enzyme(nattokinase)in the vegetable cheese natto,a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J].Experientia,1987,43(10):1110-1111.

[4]劉蒞欣，胡桃紅.血栓性疾病抗栓治療的研究進(jìn)展[J].中國臨床醫(yī)生，2013，41（5）：1-3.

[5]FSTEMEHD,MANICA N,AYDIN B,etal.Nattokinase:production and application[J].Appl M icrobiol Biotechnol,2014,98(22):9199-9206.

[6]HSIA CH,SHENM C,LIN JS,etal.Nattokinasedecreasesplasma levels of fibrinogen,factor VII,and factor VIIIin human subjects[J].Nutr Res, 2009,29(3):190-196.

[7]CAID,WEIX,QIU Y,et al.High-level expression of nattokinase in Bacillus licheniform is bymanipulating signal peptide and signal peptidase[J].J Appl M icrobiol,2016,121(3):704-712.

[8]FUJITA M,OHNISHIK,TAKAOKA S,et al.Antihypertensive effects of continuous oral adm inistration of nattokinase and its fragments in spontaneously hypertensive rats[J].Biol Pharm Bull,2011,34(11):1696-1701.

[9]ABDUIG,SRIR L.Effectof black soybean natto extract(Glycine soja) on reproduction system ofhypercholesterolemiamalemice[J].Asian Pac JReprod,2016,5(5):387-390.

[10]YUAN J,YANG J,ZHUANG Z,etal.Thrombolytic effects of Douchi fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis LD-8547 in vitro and in vivo [J].BMC Biotechnol,2012,42(8):537-544.

[11]邢峻豪，楊凌云，李清，等.抗血栓藥物的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)進(jìn)展，2014，38（3）：174-184.

[12]ROHIT K,BIBHU P P.Bioprospecting of soybean for production of nattokinase[J].Nutrafoods,2013,12(3):89-95.

[13]譚穎嫦，彭中健，夏楓耿，等.納豆激酶分離純化的工藝研究[J].現(xiàn)代食品科技，2011，27（8）：985-987.

[14]代增英，馮建嶺，李迎秋，等.納豆及納豆激酶的研究進(jìn)展[J].山東食品發(fā)酵，2013（1）：46-50.

[15]季順利，蔡俊秀，崔青，等.納豆激酶的制備及其改性研究進(jìn)展[J].中國釀造，2016，35（6）：6-10.

[16]WEIX,LUOM,LIU H.Preparation of the antithrombotic and antim icrobial coating through layer-by-layer self-assembly of nattokinasenanosilver complex and polyethylenim ine[J].Colloid Surface B,2014, 116(1):418-423.

[17]邵榮軍，陳斌，郝友進(jìn)，等.中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中溶栓酶活性檢測方法比較[J].重慶師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，29（4）：94-98.

[18]EROM P,NGCM,M IHAILOVSKIT,etal.A pilotstudy on theserum pharmacokineticsof nattokinase in humans follow ing a single,oral,daily dose[J].Altern Ther Health M ed,2013,19(3):16-19.

[19]JIA Y,LIU H,BAOW,etal.Functionalanalysisof propeptideasan intramolecular chaperone for in vivo folding of subtilisin nattokinase[J]. FEBS Lett,2010,584(23):4789-4796.

[20]CHEN B,WU Q,XU Y.Filamentous fungal diversity and community structure associated with the solid state fermentation of Chinese Maotai-flavor liquor[J].Int JFood M icrobiol,2014,179(6):80-84.

[21]M ILNERM,MAKISEK.Natto and Itsactive ingredientnattokinase:A potentand safe thrombolytic agent[J].A ltern Com plement Ther,2002, 8(3):157-164.

[22]CHEN FS,ZHANG X Y,LIZ H.Safety of fermented products based on soybean[M].Amsterdam:Elsevier Inc,2016:311-318.

[23]CHEN F,SHUANG J,MENG L,etal.Optimization of production parameters for preparation of natto-pigeon peaw ith immobilized Bacillus natto and sensory evaluationsof the product[J].Innov Food Sci Em erg Technol,2015,31(12):160-169.

[24]FENG C,JIN S,LUOM,et al.Optim ization of production parameters forpreparation ofnatto-pigeon peaw ith immobilized Bacillus,natto and sensory evaluationsof theproduct[J].Innov Food Sci Em erg Technol, 2015,31(12):160-169.

[25]WENGM,DENG X,WEIB,etal.Improving theactivity of the subtilisin nattokinase by site-directed mutagenesis and molecular dynam ics simulation[J].Biochem Bioph Res Commun,2015,465(3):580-586.

[26]JAOUADI B,ABDELMALEK B,FODIL D,et al.Purification and characterization of a thermostable keratinolytic serine alkaline proteinase from Streptomyces sp.strain AB1 w ith high stability in organic solvents[J].Bioresource Technol,2010,101(21):8361-8369.

[27]張杰，葛武鵬，陳瑛，等.納豆激酶高產(chǎn)菌株的選育及固態(tài)發(fā)酵技術(shù)[J].食品科學(xué)，2016，37（3）：151-156.

[28]王剛，郭明珠，陳光.枯草芽孢桿菌納豆激酶分離純化及酶學(xué)性質(zhì)[J].食品科學(xué)，2012，33（15）：231-234.

[29]李睿，阮文輝.納豆激酶NKⅡ分離純化及其酶促動(dòng)力學(xué)研究[J].中國釀造，2016，35（7）：89-92.

[30]CHOID B,CHAW S,PARK N,etal.Purification and characterization ofanovel fibrinolytic enzyme from fruiting bodiesof Korean Cordyceps m ilitaris[J].Bioresource Technol,2011,102(3):3279-3285.

[31]LIU JG,XING JM,CHANG T S,etal.Purification of nattokinase by reversem icelles extraction from fermentation broth:effect of temperatureand phase volume ratio[J].Bioproc Biosyst Eng,2006,28(4):267-273.

[32]GARGR,THORAT B N.Nattokinase purification by three phase partitioning and impactof t-butanolon freeze drying[J].Sep Purif Technol, 2014,131(2):19-26.

[33]JAOUADIB,ABDELMALEK B,FODIL D,et al.Purification and characterization of a thermostable keratinolytic serine alkaline proteinase from Streptomyces sp.strain AB1 w ith high stability in organic solvents[J].Bioresource Technol,2010,101(21):8361-8369.

[34]DONG X Y,KONG FP,YUAN G Y,etal.Optim isation of preparation conditionsand propertiesof phytosterol liposome-encapsulating nattok-inase[J].Nat Prod Res,2012,26(6):548-556.

[35]INGLUNG S,LIDARC,JANEYIIW.Levan production using Bacillus subtilis natto cells immobilized on alginate[J].Carbohyd Polym,2010, 82(1):111-117.

[36]WENGM Z,DENG XW,BAOW,etal.Improving the activity of the subtilisin nattokinase by site-directed mutagenesis and molecular dynamics simulation[J].Biochem Bioph Res Comm un,2015,465(3): 580-586.

[37]SINNAEVEP,VAN DW F.Thrombolytic therapy.State of the art[J]. Thromb Res,2001,103(1):71-79.

[38]SCHUTTE A E,MYBURGH A,OLSEN M H,etal.Exploring soluble urokinase plasminogen activator receptor and its relationship w ith arterial stiffness in a bi-ethnic population：the SA frEIC-study[J].Throm b Res,2012,130(2):273-277.

[39]YONG P,YANG X,ZHANG Y.M icrobial fibrinolytic enzymes:an overview of source,production,properties,and thrombolytic activity in vivo[J].Appl M icrobiol Biotechnol,2005,69(2):126-132.

[40]YANAGISAWA Y,CHATAKE T,CHIBA-KAMOSHIDA K,etal.Purification,crystallization and prelim inary X-ray diffraction experiment ofnattokinase from Bacillussubtilisnatto[J].Acta Cryst,2010,66(12): 1670-1673.

[41]WANG SL,WU Y Y,LIANG TW.Purification and biochem ical characterization ofanattokinaseby conversion of shrimp shellw ith Bacillus subtilis TKU007[J].New Biotechnol,2010,28(2):196-202.

[42]WENG TM,CHENM T.Effectof Dryingmethodson pga,isoflavone contentsand ace inhibitory activity of natto(a fermented soybean food) [J].J Food Process Pres,2012,36(6):483-488.

[43]UPADHYAY V K,KELLY A L,MCSWEENEY P LH.Use of nattokinase,asubtilisin-likeserineproteinase,to accelerateproteolysis in Cheddarcheeseduring ripening[J].Dairy Sci Technol,2006,86(3):227-240.

Research progress and prospect of nattokinase

GAO Zexin1,HELaping1,2*,LIU Yabing1,GAO Bing3,LICuiqin4,LIU Hanyu1
(1.SchoolofLiquorand Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Key Laboratory ofAgriculturaland Animal Products Store&Processing ofGuizhou Province,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.College ofBioengineering and Food Science,HubeiUniversity ofTechnology,Wuhan 430068,China;4.SchoolofChemistry and ChemicalEngineering,Guizhou University, Guiyang 550025,China)

Nattokinase is a kind of alkaline serine proteinasemainly from Bacillus subtilis and iswell known for its strong thrombolytic property. Compared w ithmostofother thrombolytic agents,ithasgood safety,low cost,easy absorption,low side effectsand other advantages,which could be developed as a promising agent for thrombosis therapy.In this paper,the thrombolytic efficacy,physicochemical properties,fermentation process, activity determination,purification,modification and products of nattokinase at home and abroad were reviewed.The key issues in the current research of nattokinasewere analyzed,and the future research direction ofnattokinasewasalso prospected.

nattokinase;thrombolysis;physicochem icalproperties;purification;modification

TS262.3

0254-5071（2017）08-0011-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.003

2017-04-25

貴州省重大專項(xiàng)項(xiàng)目子項(xiàng)目（黔科合重大專項(xiàng)字（[2015]6004-5號(hào)））；貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合支撐（[2016]2580號(hào)））

高澤鑫（1993-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩?/p>

*通訊作者：何臘平（1972-），男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程、生物催化與生物轉(zhuǎn)化。