余紹蕾 杜偉春 鴨喬

（云南綠A生物工程有限公司，云南昆明650106）

酶解結(jié)合物理法對雨生紅球藻破壁處理的工藝研究

余紹蕾*杜偉春 鴨喬

（云南綠A生物工程有限公司，云南昆明650106）

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種單細胞綠藻，屬于綠藻門（Chlorophyta）綠藻綱（Chlorophyceae）團藻目（Volvocales）紅球藻科（Haematococcaccac）紅球藻屬（Haematococcus）。雨生紅球藻在特定生態(tài)環(huán)境中能形成厚壁孢子，積累大量的蝦青素，是自然界中能夠大量合成和積累蝦青素的生物，也是自然界中天然蝦青素含量最高的生物。近年來，由于天然蝦青素的超抗氧化功效得到了廣泛認可，雨生紅球藻的需求量也不斷增加，其養(yǎng)殖、加工技術(shù)也在不斷地改進。由于雨生紅球藻的孢子壁較厚，如不進行破壁處理，蝦青素不易被提取，且吸收利用率低，故雨生紅球藻加工的關(guān)鍵技術(shù)之一就是破壁處理。傳統(tǒng)的破壁方法主要為物理法，但存在缺陷。本研究采用酶解結(jié)合物理技術(shù)對雨生紅球藻進行破壁處理，以期為雨生紅球藻破壁技術(shù)提供更好的方法。

1 材料與儀器

1.1 材料

雨生紅球藻粉，云南綠A生物工程有限公司；復合纖維素酶、復合果膠酶、復合多糖酶，諾維信（中國）投資有限公司。

1.2 試劑

二甲基亞砜（DMSO）、二氯甲烷、正己烷，均為分析純。

1.3 儀器

紫外分光光度計，上海光譜儀器有限公司；高壓均質(zhì)破壁機，上海陽溢生物科技有限公司；磁力攪拌機，鄭州新中原機器制造有限公司。

2 試驗方法

2.1 酶法-高壓均質(zhì)破壁工藝流程

精確稱取干燥的雨生紅球藻粉100 g，加入純化水900 mL，搖勻，加入檸檬酸調(diào)節(jié)pH值，按試驗設(shè)計量加入復合果膠酶，控制反應溫度緩慢攪拌，到達反應時間后，倒入均質(zhì)機進行高壓均質(zhì)，均質(zhì)壓力40 MPa，均質(zhì)2次。均質(zhì)后噴霧干燥，得破壁雨生紅球藻粉。

2.2 高壓均質(zhì)破壁工藝流程

精確稱取干燥的雨生紅球藻粉100 g，加入純化水900 mL，搖勻，倒入均質(zhì)機進行高壓均質(zhì)，均質(zhì)壓力40 MPa，均質(zhì)2次。均質(zhì)后噴霧干燥，得破壁雨生紅球藻粉。

2.3 破壁率檢測方法

2.3.1 二甲基亞砜提取及蝦青素含量的測定

準確稱量藻粉W1mg（約20 mg）于10 mL離心管中，加入5 mL DMSO，70℃提取5min，提取過程中搖動離心管，使藻粉與溶劑混勻，促進蝦青素的提取；5 000 r/min離心5 min，收集上清液；重復提取1次，合并提取液，用DMSO定容至25 mL，充分混勻后取1 mL于10 mL容量瓶中，用DMSO定容后，用1 cm光徑比色杯，在530 nm處測量吸光值，計算樣品蝦青素含量：

式中：C1——樣品中蝦青素含量，%；

A1——530 nm處樣品的吸光值；

W1——稱取藻粉的質(zhì)量，mg。

2.3.2 二氯甲烷-正己烷提取及蝦青素含量的測定

準確稱量藻粉W2mg（約20 mg）于10 mL離心管中，加入5 mL二氯甲烷-正己烷（7∶3）混合溶液，室溫提取蝦青素，提取過程中搖動離心管，使藻粉與溶劑混勻，促進蝦青素的提?。? 000 r/min離心5 min，收集上清液；重復提取1次，合并提取液，用二氯甲烷-正己烷（7∶3）混合溶液定容為25 mL，充分混勻后取1 mL于10 mL容量瓶中，用二氯甲烷-正己烷（7∶3）混合溶液定容后，用1 cm光徑比色杯在530 nm處測量吸光值，計算樣品蝦青素含量：

式中：C2——樣品中蝦青素的含量，%；

A2——530 nm處樣品的吸光值；

W2——稱取藻粉的質(zhì)量，mg。

2.3.3 破壁孢子率計算

式中：R——破壁孢子率，%；

C1——二甲基亞砜提取時樣品中蝦青素含量，%；

C2——二氯甲烷-正己烷提取時樣品中蝦青素含量，%。

2.4 酶解參數(shù)篩選

以酶的種類（A）、酶解溫度（B）、酶解時間（C）、酶添加量（D）為4個因素，分別設(shè)置3個水平，以破壁孢子率為評價指標，進行L9（34）正交試驗。正交試驗因素水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素與水平

2.5 對比試驗

分別以正交試驗得出的最佳工藝參數(shù)進行3次重復試驗，與物理破壁法得到的破壁率進行比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 正交試驗結(jié)果與分析

正交試驗結(jié)果及分析見表2。

表2 正交試驗設(shè)計結(jié)果與分析

由極差分析可知，各因素對破壁率影響的主次順序為：酶的種類＞酶解溫度＞酶添加量＞酶解時間。根據(jù)正交試驗確定的酶反應最佳條件為：A2B2C2D2，即酶種類為復合纖維素酶，酶解溫度45℃，酶添加量0.5%，酶解時間5 h。

3.2 對比試驗結(jié)果

對比試驗結(jié)果表明，采用酶法-高壓均質(zhì)破壁法對雨生紅球藻粉進行破壁，其破壁孢子率較高壓均質(zhì)法提高了18.07%，對比試驗結(jié)果見表3。

表3 對比試驗結(jié)果

4 討論

雨生紅球藻的有效成分—蝦青素，存在于其厚壁細胞中，為使其含有的蝦青素能得以應用，必須要對其進行破壁處理。2011年國家衛(wèi)生部已批準了雨生紅球藻粉為新資源食品，將其破壁處理后，提取出來的蝦青素可用于食品、保健食品、化妝品、藥品等諸多領(lǐng)域。傳統(tǒng)的破壁法主要是物理破壁法，包括高壓均質(zhì)法、超聲波法、冷凍法等。其中，高壓均質(zhì)法對高壓均質(zhì)機的要求較高，且生產(chǎn)中設(shè)備零件損耗較大，常常不能連續(xù)生產(chǎn)；超聲波法設(shè)備昂貴、批處理量少，不適合于大規(guī)模生產(chǎn)；凍融法能耗大、操作周期長，且提取破壁效率低下。酶解法是近年來發(fā)展較為快速的提取方法之一，在中藥的提取中，常用其進行預處理，可大大提高有效成分的提取效率。

本研究選用了酶法結(jié)合高壓均質(zhì)法進行雨生紅球藻的破壁處理，以期能夠改善原高壓均質(zhì)破壁存在的問題。孢子主要由纖維素、果膠、脂多糖等物質(zhì)給成，故選取了纖維素酶、果膠酶和多糖酶對孢子進行處理，并對反應條件進行了篩選。試驗結(jié)果表明，采用復合纖維素酶，酶添加量0.5%，酶解溫度45℃，酶解時間5 h條件下，酶解法結(jié)合高壓均質(zhì)破壁效果最好；對比試驗結(jié)果顯示，結(jié)合酶解法后，雨生紅球藻的破壁孢子率提高了18.07%。在生產(chǎn)過程中，此方法對設(shè)備的磨損大大減少，機器可正常連續(xù)運轉(zhuǎn)。其作用機理可能是通過纖維素酶使雨生紅球藻孢子中的部分纖維素得以降解，從而降低孢子的硬度，利于后續(xù)高壓均質(zhì)的操作。酶解結(jié)合高壓均質(zhì)破壁相對于其他破壁法具有提取效率高、成本低、適于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點，有一定的推廣價值。

［1］高桂玲，成家楊，馬炯.雨生紅球藻和蝦青素的研究［J］.水產(chǎn)學報，2014，38（2）：297-304.

［2］周錦珂，李金華，葛發(fā)歡，等.酶法提取雨生紅球藻中蝦青素的新工藝研究［J］.中藥材，2008，31（9）：1 423-1 425.

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Study of the cellwall-breaking process by enzyme combined with physical method for haematococcus pluvialis

YUShaolei*DUWeichun YA qiao

（Yunnan green A biological project Co.,Ltd，Yunnan Kunming 650106，China）

采用酶解結(jié)合物理法對雨生紅球藻的破壁工藝進行了研究，以破壁孢子率為評價指標，通過正交試驗篩選酶解條件，對比試驗進行驗證。試驗結(jié)果表明，雨生紅球藻的最佳破壁工藝為：選用復合纖維素酶對雨生紅球藻進行酶解處理，酶添加量0.5%，酶解溫度45℃，酶解時間5 h，酶解后結(jié)合高壓均質(zhì)法進行破壁，均質(zhì)壓力40 MPa，均質(zhì)2次。在此工藝條件下，雨生紅球藻的破壁孢子率較原工藝提高18.07%。酶解結(jié)合高壓均質(zhì)法用于雨生紅球藻粉破壁具有效率高、成本低的優(yōu)點，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

雨生紅球藻；蝦青素；酶解；高壓均質(zhì)；破壁

Tostudy the cell wall-breakingprocess byenzyme combined with physical method for Haematococcus pluvialis.Methods:Cell wall-breaking rate was as the evaluation index.Orthogonal test method was used toconcern enzymolysis conditions,and verified by contrast experiment.Results:The enzymolysis conditions identified as:composite cellulose enzyme,addingamount of0.5%,enzyme solution temperature 45℃,enzymolysis time 5 h,homogeneous pressure 40 Mpa,homogeneous 2 times.Compared with the original method,cell wall-breaking rate ofnewmethod increased 18.07%.Conclusion:Enzyme combined with physical method is high efficiency,low cost for breaking Haematococcus pluvialiscell wall,and is suitable for industrialized production.

haematococcus pluvialis；astaxanthin;enzymolysis；high pressure homogeneous；cell disruption

TS254.7

A

1673-6044（2016）04-0038-03

10.3969/j.issn.1673-6044.2016.04.010

*余紹蕾，女，1983年出生，2008年畢業(yè)于暨南大學藥理學專業(yè)，工程師。

2016-11-25