馬 軒，李盛本，莫蓓莘，曹曉風，陳雪梅,4

1)深圳大學生命與海洋科學學院，廣東深圳518060；2)中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所，北京100101；3)中國農業(yè)科學院深圳農業(yè)基因組研究所，廣東深圳518120；4)美國加利福尼亞大學河濱分校植物科學系, 加利福尼亞河濱CA 92521，美國

【生物工程 / Bioengineering】

擬南芥ago1-27突變體的RNA-seq分析

馬 軒1,2，李盛本3，莫蓓莘1，曹曉風2，陳雪梅1,4

1)深圳大學生命與海洋科學學院，廣東深圳518060；2)中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所，北京100101；3)中國農業(yè)科學院深圳農業(yè)基因組研究所，廣東深圳518120；4)美國加利福尼亞大學河濱分校植物科學系, 加利福尼亞河濱CA 92521，美國

miRNA在植物生長發(fā)育和環(huán)境適應等方面起著極為重要的作用．本研究對擬南芥ago1-27突變體進行了RNA-seq，鑒定到幾千個差異表達基因，并且miRNA靶基因傾向于在ago1-27中表達上調．ago1-27 RNA-seq結合降解組分析鑒定到新的miRNA靶基因，如miR396靶向半胱氨酸蛋白酶基因和miR167靶向編碼AT-hook DNA結合蛋白的基因等．

植物生物化學；miRNA；ago1-27基因；RNA-seq；降解組；靶基因；擬南芥

小核糖核酸(microribonucleic acid, microRNA或miRNA)是一類長度約為20～24個核苷酸的內源非編碼RNA．miRNA與Argonaute(AGO)蛋白相結合，對靶RNA進行RNA剪切或翻譯抑制[1-4]．植物miRNA在植物形態(tài)建成、生長發(fā)育和環(huán)境適應等方面起著極為重要的作用[3-4]．自2002年首次證實植物中存在miRNA[5]以來，關于植物miRNA的研究進展異常迅速．植物miRNA和靶RNA之間互補緊密，因此，miRNA的靶基因預測較為容易．模式匹配程序scan_for_matches最早被應用于植物miRNA靶基因預測[6]．之后，以序列匹配程序FASTA為基礎的工具，如Targetfinder和psRNATarget能夠快速預測植物靶基因[7-8]．降解組(degradome)測序使miRNA靶基因的大規(guī)模鑒定成為可能，目前已廣泛用于各種植物miRNA靶基因的鑒定中[9-10]．

目前已經確認的miRNA靶基因，主要是互補緊密的類型，并集中在高度保守的miRNA上．本研究對模式植物擬南芥的ago1-27突變體進行了RNA-seq，得到了新的候選miRNA靶基因．結合降解組測序數據分析，鑒定出新的miRNA靶基因．

1 材料與方法

1.1 RNA-seq

擬南芥野生型(wild type, WT)和ago1-27突變體的花序用于RNA-seq．使用TRIzol(Invitrogen)提取花序的總RNA．每個樣品制備3個生物學重復．使用TruSeq試劑盒(Illumina)構建RNA-seq文庫．在IlluminaHiSeq 2500平臺上進行50-nt單端非鏈特異性RNA-seq．原始測序數據已經提交至NCBI SRA數據庫(數據號GSE77211)．

1.2 生物信息學分析

使用Tophat(v2.0.11，默認參數)將RNA-seq數據與擬南芥基因組(TAIR10)比對，唯一定位的讀段(reads)用于后續(xù)的分析．應用Cuffdiff進行基因表達分析，采取的標準為：① FDR(false discovery rate)<0.05；② 基因差異表達>2倍．擬南芥miRNA數據源于miRBase(v21)，已驗證的miRNA靶基因數據源于TarBase(v6.0)．miRNA靶基因預測應用TarHunter-L(https://github.com/XMaBio/TarHunter-L)．降解組數據應用CleaveLand4進行分析，采用的標準是：① 0類或1類；② 罰分<5.0；③ 剪切位點reads豐度≥10×TP10M，TP10M(transcripts per ten million)為剪切位點reads數占每千萬總reads數的比例．

2 結果分析

2.1 擬南芥ago1-27 RNA-seq

圖1 三種RNA-seq分析流程比較Fig.1 Comparison of three RNA-seq analysis methods

對擬南芥野生型和ago1-27突變體植物進行RNA-seq，每個樣品進行3個生物學重復．首先比較3種分析RNA-seq數據的流程方法：Tophat2-Cuffdiff、Tophat2-HTSeq-edgeR和Tophat2-HTSeq-DESeq．采用的標準是：① FDR(或調整的P值)<0.05；② 基因差異表達>2.0．Cuffdiff、DESeq和edgeR 3種流程分別鑒定到1 862、1 823和2 387 個差異表達基因，大多數差異表達基因都能被3種方法檢測到，如圖1(a)．其中，edgeR具有較高的靈敏度，DESeq具有最高的特異性．對這3種方法進行兩兩比較，基因差異表達的倍數(FC為ago1和WT基因差異表達倍數)變化相關性很高(Pearson相關系數> 0.99)，如圖1(b)和(c)，說明該分析方法可靠．因為Cuffdiff方法平衡了靈敏性和特異性，以下結果將基于Cuffdiff的分析方法．同時對3個生物重復進行了比較，3個生物學樣品具有高度可重復性(Pearson相關系數> 0.996，如圖2(a)和(b)，這充分說明了分析樣品的可靠性．

圖2 三個生物學重復的基因表達譜比較和相關性分析Fig.2 Global gene expression profiles and correlations of three biological replicates

2.2 miRNA靶基因在ago1-27中上調

觀察到在ago1-27突變體中AGO1基因的表達值升高，如圖3，RPKM(reads per kilobases per million reads)為基因表達值單位．對于這一現(xiàn)象，筆者的解釋是：首先， AGO1是miR168的靶基因；在ago1-27突變體中，miRNA與內質網的關聯(lián)程度下降[11]，而內質網膜是miRNA作用的重要場所[11-12]，因此在ago1-27中miRNA靶基因的表達失調．應用Cuffdiff在ago1-27突變體中鑒定到689個上調基因和1 175個下調基因，上調和下調的基因中包含24和5個已經驗證的miRNA靶基因．這個結果顯示，已經確認的miRNA靶基因傾向于富集在ago1-27上調的基因中(Fisher’s exact test，P值= 6.97×10-7)．

圖3 AGO1基因在ago1-27和野生型中的表達Fig.3 AGO1 gene expressions in ago1-27 and WT

2.3ago1-27 RNA-seq結合降解組分析鑒定新的miRNA靶基因

應用TarHunter-L(見第1章“材料與方法”)預測擬南芥miRNA在編碼序列上的靶位點．如圖4(a)，罰分≤3.0的靶基因在ago1-27突變體中的表達比在野生型的高，而非靶基因在ago1-27中的表達與野生型相當．在ago1-27中上調的預測的靶基因(罰分≤3)中，17個沒有報道過(表1)．這17個基因包括5個miR396靶基因，還有一些保守miRNA(如miR172和miR167等)的靶基因．

圖4 ago1-27 RNA-seq結合降解組鑒定到新的miRNA靶基因Fig.4 ago1-27 RNA-seq combined with degradome analysis identified novel miRNA targets

miRNA靶基因FC是否受降解組支持 基因注釋miR165AT5G570351．50否U?boxdomain?containingproteinkinasefamilyproteinmiR172d?3pAT4G246301．63是DHHC?typezincfingerfamilyproteinmiR390AT2G200101．63否proteinofunknownfunction(DUF810)miR167AT5G199501．68否domainofunknownfunction(DUF1767)miR840AT1G150201．70否quiescin?sulfhydryloxidase1miR846AT5G019501．71否leucine?richrepeatproteinkinasefamilyproteinmiR172AT3G573301．72否autoinhibitedCa2+?ATPase11miR394AT5G096702．03否loricrin?relatedmiR5663?3pAT4G133302．39否S?adenosyl?L?methionine?dependentmethyltransferasessuperfamilyproteinmiR846AT1G337902．57否jacalinlectinfamilyproteinmiR169AT1G1347019．42否proteinofunknownfunction(DUF1262)miR167AT3G613101．57是AThookmotifDNA?bindingfamilyproteinmiR396AT3G010401．55是galacturonosyltransferase13miR396AT5G430601．64是granulinrepeatcysteineproteasefamilyproteinmiR396AT1G601401．75是trehalosephosphatesynthasemiR396AT3G194001．67是cysteineproteinasessuperfamilyproteinmiR396AT1G800602．85是ubiquitin?likesuperfamilyprotein

為進一步確認通過ago1-27 RNA-seq分析得到的靶基因，對已發(fā)表的降解組數據(包括花序和葉片等4個測序文庫)進行了分析，鑒定到22個miR396靶基因，包括一些新的靶基因，如FLU、LSU2、RD21B和AT4G32250等．miRNA在靶位點的剪切效率以TP10M表示．在這22個miR396靶基因中，5個沒有在ago1-27 RNA-seq中檢測到，其余17個基因中的13個在ago1-27突變體中上調變化> 1.5倍，因此，ago1-27 RNA-seq結合降解組分析能有效鑒定miRNA靶基因．

通過ago1-27 RNA-seq分析，還鑒定到AHL11(AT3G61310)是miR167潛在的靶基因，因為它在ago1-27中的表達上調1.6倍．對降解組數據的分析顯示，AHL11確實是miR167的靶基因，如圖4(b)．另外，鑒定到一個果膠甲酯酶(pectin methylesterase,PME)基因AT5G64640是miR156潛在的靶基因，因為它在ago1-27突變體中上調1.6倍，并且受4個降解組數據(成葉、幼葉、野生型花序和xrn4花序)的支持，如圖4(c)． AT5G64640被劃分為A組PME，其在長角果中高度或獨特地表達; 該結果說明，miR156除調節(jié)SQUAMOSA PROMOTER(SPL)外，還具有調控其他基因的新功能．

3 討 論

本研究對ago1-27突變體進行了RNA-seq，發(fā)現(xiàn)許多已確認的miRNA靶基因在ago1-27中表達上調．以往的研究對少數幾個miRNA靶基因進行了分析，在RNA水平它們在ago1-27中表達上調；在蛋白水平它們在ago1-27中上調更為明顯[13]．因此，ago1-27點突變可能主要影響了miRNA介導的翻譯抑制過程．文獻[11]的研究表明，在ago1-27中miRNA與內質網膜的關聯(lián)度下降．由于內質網膜是蛋白翻譯的重要場所[14-16]，miRNA與膜的解離可能導致miRNA介導的翻譯抑制過程的失調．

目前已確認的miRNA靶基因集中在保守miRNA和緊密互補的類型上[17]，新的證據表明松弛配對類型的靶基因確實存在[18-20]．本研究結合miRNA靶基因預測、降解組數據和ago1突變體RNA-seq分析，鑒定出新的miRNA靶基因，這有助于深入認識植物miRNA和靶基因的調控網絡．

/ References：

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【中文責編：晨 兮；英文責編：艾 琳】

RNA-seq analysis onArabidopsisago1-27 mutant

Ma Xuan1,2, Li Shengben3, Mo Beixin1, Cao Xiaofeng2, and Chen Xuemei1,4?

1)College of Life Sciences and Oceanography, Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong Province, P.R.China 2)Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101, P.R.China 3)Shenzhen Institute of Agricultural Genomics, Chinese Academy of Agricultural Sciences,Shenzhen 518120, Guangdong Province, P.R.China 4)Department of Botany and Plant Sciences, Institute of Integrative Genome Biology, University of California, Riverside, California 92521, USA

miRNAs play important roles in plant development and adaptation to environment. We conduct the RNA-seq of Arabidopsisago1-27 mutant and has identified thousands of differentially expressed genes. The study shows that miRNA targets tend to be upregulated in theago1-27 mutant. New miRNA targets are identified byago1-27 RNA-seq combined with degradome analysis. For examples, miR396 targets cysteine proteinase genes and miR167 targets a gene encoding AT-hook DNA-binding protein.

phytobiochemistry; microribonucleic acid (miRNA);ago1-27; RNA-seq; degradome; target genes;Arabidopsis

Received：2016-12-23；Accepted：2016-12-27

Foundation：National Natural Science Foundation of China (31571332, 31210103901, 91440105)

? Corresponding author：Academician of American Academy of Sciences, Professor Chen Xuemei. E-mail: xuemei.chen@ucr.edu

：Ma Xuan, Li Shengben, Mo Beixin, et al. RNA-seq analysis onArabidopsisago1-27 mutant[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2017, 34(1): 27-32.(in Chinese)

Q 946.2

A

10.3724/SP.J.1249.2017.01027

國家自然科學基金資助項目(31571332，31210103901，91440105)

馬 軒(1978—)，男，深圳大學博士后研究人員. 研究方向：植物miRNA介導的翻譯抑制機理. E-mail: xuanma@genetics.ac.cn

引 文：馬 軒，李盛本，莫蓓莘，等. 擬南芥ago1-27突變體的RNA-seq分析[J]. 深圳大學學報理工版，2017，34(1)：27-32.