李建柱，侯 杰，張鵬飛，柳堯全，夏閏紅，馬徐發(fā)（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430070）

空心菜浮床對(duì)魚塘水質(zhì)和微生物多樣性的影響

李建柱，侯 杰，張鵬飛，柳堯全，夏閏紅，馬徐發(fā)*（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430070）

為從環(huán)境微生物的角度探討生物浮床的水質(zhì)調(diào)節(jié)機(jī)理，采用宏基因組學(xué)測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)手段，分析了環(huán)境微生物和根系微生物群落的多樣性.研究結(jié)果表明，魚菜共生模式下優(yōu)勢(shì)菌門是變形菌門（Proteobacteria）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和厚壁菌門（Firmicutes）等，主要菌屬是聚球藻屬（Synechococcus）、hgcI_clade、CL500-29_marine_group、芽孢桿菌屬（Bacillus）和分支桿菌屬（Mycobacterium）等；空心菜根系微生物群落中最豐富的優(yōu)勢(shì)菌門是變形菌門和藍(lán)細(xì)菌門，主要菌屬是紅細(xì)菌屬（Rhodobacter）、噬氫菌屬（Hydrogenophaga）和聚球藻屬等.研究結(jié)果還表明低覆蓋率（3.5%）的空心菜生物浮床能夠增加水體的溶解氧含量，降低水體中含氮化合物的濃度和改善養(yǎng)殖環(huán)境中的微生態(tài)平衡，提高有益菌和氮循環(huán)細(xì)菌的含量.

空心菜浮床；環(huán)境微生物多樣性；水質(zhì)；16S rDNA

池塘養(yǎng)殖是中國(guó)主要的淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖方式，由養(yǎng)殖導(dǎo)致的環(huán)境污染日益引起了人們的擔(dān)憂.廢氮積累是水產(chǎn)養(yǎng)殖的一個(gè)主要缺點(diǎn)［1］，這些廢物通常是養(yǎng)殖生物以氨氮的形式排泄［2-3］，氨氮對(duì)養(yǎng)殖生物具有長(zhǎng)期重毒作用［4-5］.另外，亞硝酸氮對(duì)養(yǎng)殖生物也具有毒性作用［6-7］.因此，尋求一個(gè)高效科學(xué)健康的治理養(yǎng)殖水污染的措施或更加可持續(xù)發(fā)展的養(yǎng)殖模式是亟待解決的問(wèn)題.

魚菜共生模式是一種結(jié)合生物浮床技術(shù)的新型健康生態(tài)養(yǎng)殖模式.研究表明生物浮床技術(shù)革命性地推進(jìn)了水質(zhì)凈化技術(shù)的發(fā)展，提高了空間利用效率，在凈化水質(zhì)的同時(shí)，也可以產(chǎn)生一定的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益［8-10］，具有非常廣泛的應(yīng)用前景.目前，對(duì)魚菜共生模式的研究多側(cè)重于研究選用不同浮床植物對(duì)污染水體的凈化效果［11-14］，而對(duì)浮床植物根系微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性及其變化研究較少，且沒(méi)有從整個(gè)環(huán)境中全部微生物的角度對(duì)生物浮床水質(zhì)調(diào)節(jié)機(jī)理做出一個(gè)科學(xué)的解釋.因此，研究魚菜共生模式中環(huán)境微生物和浮床植物根系微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性，對(duì)深入探討生物浮床的水體調(diào)節(jié)機(jī)理具有非常重要的意義.本研究旨在通過(guò)宏基因組學(xué)等分子生物學(xué)方法，揭示生物浮床對(duì)魚菜共生模式中微生物多樣性的影響，并從微生物的角度對(duì)生物浮床水質(zhì)調(diào)節(jié)機(jī)理做出一個(gè)科學(xué)的解釋，為養(yǎng)殖水體生物調(diào)控技術(shù)的推廣與應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)點(diǎn)位于湖北省紅安縣中海農(nóng)業(yè)科技有限公司高橋養(yǎng)殖基地，選取6個(gè)基本條件（養(yǎng)殖年限、面積、水深、水源與魚類放養(yǎng)模式等）一致的草魚精養(yǎng)池塘，其中3個(gè)水面上架設(shè)覆蓋率為3.5% 的空心菜生物浮床構(gòu)建魚菜共生模式作為實(shí)驗(yàn)組，3個(gè)池塘為空白對(duì)照組.為防止草魚攝食植物根系，本實(shí)驗(yàn)制作的生物浮床植物載體采用了雙層PE網(wǎng)，把空心菜移植在上層網(wǎng)片上，成功防止植物根系被魚類攝食.本試驗(yàn)周期為2015-06-10～2015-08-23.池塘面積為0.80hm2，平均水深1.80m.每天用商業(yè)魚飼料（草魚707系列，海大集團(tuán)）投喂2次（08：30和15：30）.

1.2 水質(zhì)監(jiān)測(cè)方法

水質(zhì)理化參數(shù)溶解氧（DO）、溫度（T）和pH用HACH HQ 40d便攜式多參數(shù)水質(zhì)分析儀實(shí)時(shí)測(cè)得.

定期采取離水面50cm深處的水層水樣，在每個(gè)養(yǎng)殖池塘選取5個(gè)取樣點(diǎn)取同等體積的水樣，混合均勻后即為全層多點(diǎn)取樣.測(cè)定方法參照《水質(zhì)—中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》測(cè)定，其中總氮（TN）用堿性過(guò)硫酸鉀消解，紫外分光光度法測(cè)定；硝態(tài)氮測(cè)定采用酚二磺酸分光光度法；總氨氮（TAN）采用納氏試劑比色法；亞硝態(tài)氮采用磺胺試劑分光光度計(jì)比色法［15-18］.

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的各個(gè)水質(zhì)參數(shù)平均15d監(jiān)測(cè)1次，共5次，編號(hào)分別為T和C.

1.3 樣品收集與DNA提取

本實(shí)驗(yàn)所有菌體樣品均于2015-8-03上午采集.

水體菌體收集：采用5 點(diǎn)取樣法，用高溫滅菌的有機(jī)玻璃取水器采取每個(gè)養(yǎng)殖池塘水深50cm的池水，每個(gè)樣取樣量大體一致，均勻混合后裝入滅菌的三角燒瓶，隨后將50mL水樣用0.22pm的濾膜過(guò)濾后，將濾膜置于無(wú)菌冷凍管中.泥樣采集：采用3點(diǎn)取樣法，3個(gè)采集點(diǎn)均位于投食區(qū)，用采泥器采集每個(gè)池塘采樣點(diǎn)的底泥，混勻并置于無(wú)菌冷凍管中.根系菌體收集：隨機(jī)剪取空心菜根系，懸浮于PBS緩沖溶液中，所得的懸浮液即為根面菌液，搖勻，然后用0.22pm的濾膜過(guò)濾100mL根面菌液，將濾膜置于無(wú)菌冷凍管中.上述所有樣品均置于-20℃保存?zhèn)溆?，直至提取DNA.

實(shí)驗(yàn)組水體和沉積物的樣品編號(hào)分別為ST（ST1～ST3）和NT（NT1～NT3），對(duì)照組水體和沉積物的樣品編號(hào)SC（SC1～SC3）和NC（NC1～NC3），空心菜根系樣品編號(hào)為R（R1～R3）.使用Soil DNA Kit試劑盒（OMEGA，美國(guó)）提取上述所有樣品的DNA.所有樣品的 DNA 提取步驟均參照Soil DNA Kit試劑盒說(shuō)明書，并對(duì)提取到的樣品基因組 DNA用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量.

1.4 高通量測(cè)序分析

針對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3+V4區(qū)設(shè)計(jì)含barcode的特異引物338F/806R，引物序列為：338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'），806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）.PCR擴(kuò)增采用rTaq DNA Polymerase-20μL反應(yīng)體系：10×Buffer 2μL，2.5mmol/L dNTPs 2μL，引物338F/806R各0.8μL，Taq酶0.2μL， BSA 0.2μL，模板DNA10ng，補(bǔ)ddH2O至20μL. PCR條件：95℃變性 3min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，27個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10min延伸（PCR儀：ABⅠGeneAmp? 9700型）.

PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶清晰，片段大小合適（430bp左右），使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（Axygen，美國(guó)）切膠回收PCR產(chǎn)物，以Tris-HCl 洗脫后連接“Y”接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段，按照每個(gè)樣品測(cè)一萬(wàn)條序列加入1ng PCR產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)富集PCR產(chǎn)物，然后用0.1mol/L的NaOH 溶液變性，獲得單鏈DNA片段，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)后在16S-338F-806R Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序（美吉生物，上海）.

1.5 數(shù)據(jù)分析

對(duì)獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)，用 MOTHUR 軟件結(jié)合EXCEL和SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析.數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析以每個(gè)樣品中可操作的分類單元（OUT，分類單元是分類工作中的客觀操作單位，有特定的名稱和分類特征，是指具體的分類群，可能是菌株、種或?qū)俚?，將每個(gè)分類單位統(tǒng)稱為一個(gè)操作分類單位）作為分類和計(jì)算的依據(jù)，并設(shè)置差異顯著性水平P = 0.05，當(dāng)P＜0.05時(shí)表示顯著性差異.

2 結(jié)果

2.1 水質(zhì)指標(biāo)

表1 水質(zhì)的物理參數(shù)Table 1 Physical parameter of water in Control and Test

圖1 試驗(yàn)期間總氮、總氨氮、硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度的變化Fig.1 Variration of TN， TAN， nitrate， and nitrite concentrations during the study period

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的DO濃度、pH值和溫度的監(jiān)測(cè)結(jié)果如表1所示，且各參數(shù)之間并沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）.由研究結(jié)果可知魚菜共生系統(tǒng)中的pH值和溫度與非魚菜共生系統(tǒng)的基本相同；但魚菜共生模式下水體的DO濃度明顯較高，分別為（4.15±0.79）mg/L和（3.34±1.00）mg/L.說(shuō)明魚菜共生系統(tǒng)中水質(zhì)的理化性質(zhì)比非魚菜共生系統(tǒng)中更優(yōu)良，更有利于魚類養(yǎng)殖.

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的總氮、硝酸鹽、亞硝酸鹽和總氨氮的濃度變化如圖1所示，且各參數(shù)之間并沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）.由研究結(jié)果可知實(shí)驗(yàn)組TN濃度的波動(dòng)范圍為1.76～2.18mg/L，對(duì)照組TN濃度的波動(dòng)范圍為1.72～2.32mg/L，且2個(gè)組別的總氮濃度都呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組TN的濃度一直低于對(duì)照組TN的濃度；實(shí)驗(yàn)組亞硝酸鹽濃度的波動(dòng)范圍為0.06～0.11mg/L，對(duì)照組亞硝酸鹽濃度的波動(dòng)范圍為0.05～0.34mg/L，實(shí)驗(yàn)組亞硝酸鹽的濃度明顯低于對(duì)照組亞硝酸鹽的濃度；實(shí)驗(yàn)組TAN濃度的波動(dòng)范圍為0.05～0.17mg/L，對(duì)照組TAN濃度的波動(dòng)范圍為0.08～0.19mg/L；實(shí)驗(yàn)組硝酸鹽濃度的波動(dòng)范圍為0.09～0.27mg/L，對(duì)照組硝酸鹽濃度的波動(dòng)范圍為0.06～0.25mg/L，實(shí)驗(yàn)組硝酸鹽的濃度高于對(duì)照組硝酸鹽的濃度（圖1）.這些結(jié)果說(shuō)明盡管生物浮床能夠降低水環(huán)境中的總氮、亞硝酸鹽和總氨氮濃度，有利于保持養(yǎng)殖水，境的良好，但養(yǎng)殖過(guò)程中含氮化合物會(huì)不斷累積，需要適時(shí)調(diào)節(jié)水質(zhì)，保證健康養(yǎng)殖.

2.2 樣品細(xì)菌群落多樣性

對(duì)各個(gè)樣品的有效序列進(jìn)行系譜分類，以97%相似性水平為標(biāo)準(zhǔn)劃分操作分類單元（OUT），SC、ST、NC、NT和R樣品數(shù)據(jù)分別可劃分為833、962、1989、2164和986個(gè)OUT（表2）.通過(guò)計(jì)算在同一樣本中檢測(cè)到的隨機(jī)選擇擴(kuò)增子序列的覆蓋率進(jìn)行評(píng)估抽樣的完整性.OTUs的覆蓋率的范圍是99.17%～99.63%（表2），表明本研究樣品中的大多數(shù)微生物種類都被檢測(cè)到了.由樣品的菌群豐度指數(shù)（Ace和Chao）可知實(shí)驗(yàn)組水體和沉積物的微生物豐度高于對(duì)照組；由樣品的多樣性指數(shù)（Shannon和Simpson）可知實(shí)驗(yàn)組水體的微生物多樣性低于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組沉積物的微生物多樣性高于對(duì)照組（表2）.這些研究結(jié)果表明與非魚菜共生模式相比，魚菜共生模式中養(yǎng)殖水環(huán)境中微生物具有高豐度和低多樣性，沉積物中微生物具有高豐度和高多樣性，進(jìn)而表明空心菜生物浮床有效改變了養(yǎng)殖環(huán)境中的微生態(tài)平衡.

表2 樣品的多樣性指數(shù)Table 2 Alpha-diversity of the samples

2.3 菌群結(jié)構(gòu)組成

對(duì)有效序列進(jìn)行系譜分類，統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣品中重要的細(xì)菌門類及其相對(duì)豐度，共得到了10個(gè)重要菌門，分別是變形菌門（Proteobacteria）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、酸 桿 菌 門 （Acidobacteria）、 浮 霉 菌 門（Planctomycetes）和綠菌門（Chlorobi）（表3）.研究結(jié)果表明，門類學(xué)水平上，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組環(huán)境微生物中最豐富的優(yōu)勢(shì)菌門是變形菌門和藍(lán)細(xì)菌門，但2個(gè)組別水環(huán)境中藍(lán)細(xì)菌門的相對(duì)豐度明顯高于其沉積物，變形菌門的相對(duì)豐度明顯低于其沉積物.實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組水環(huán)境微生物群落中放線菌門和浮霉菌門的相對(duì)豐度均明顯高于其沉積物，梭桿菌門和酸桿菌門的相對(duì)豐度均明顯低于比其沉積物.空心菜根系微生物群落中的變形菌門和藍(lán)細(xì)菌門占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)（52.80%和25.77%）.

篩選出每類樣品中相對(duì)豐度最高的前10種明確分類的微生物群落，并在菌屬水平上對(duì)每類樣品的菌群結(jié)構(gòu)及分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（圖2）.實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的水環(huán)境中最主要的優(yōu)勢(shì)菌屬是聚球藻屬（Synechococcus）、hgcI_clade、芽孢桿菌屬（Bacillus）、CL500-29_marine_group、分支桿菌屬（Mycobacterium）、CL500-3和Polynucleobacter等菌屬.實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的沉積物中最主要的優(yōu)勢(shì)菌屬是聚球藻屬、擬浮絲藻屬（Planktothricoides）、芽孢桿菌屬、鯨桿菌屬（Cetobacterium）、Dechloromonas和厭氧粘細(xì)菌屬（Anaeromyxobacter）.實(shí)驗(yàn)組水環(huán)境中的聚球藻屬、芽孢桿菌屬、CL500-3和分支桿菌屬的相對(duì)豐度均高于對(duì)照組，Polynucleobacter、CL500-29_marine_group和hgcI_clade的相對(duì)豐度均低于對(duì)照組，其中聚球藻屬的相對(duì)豐度明顯高于對(duì)照組，分別為42.16%和31.51%.實(shí)驗(yàn)組沉積物中的聚球藻屬的相對(duì)豐度明顯高于對(duì)照組，分別為5.19%和2.16%；擬浮絲藻屬的相對(duì)豐度明顯低于對(duì)照組，分別為2.35%和11.05%； Dechloromonas的相對(duì)豐度明顯低于對(duì)照組，分別為1.95%和3.78%.空心菜根系的前10種優(yōu)勢(shì)菌落是紅細(xì)菌屬（Rhodobacter）、噬氫菌屬（Hydrogenophaga）、聚球藻屬、Meganema、紅芽生菌屬（Rhodoblastus）、芽孢桿菌屬、Shinella、玫瑰彎菌屬（Roseiflexus）、球衣菌屬（Sphaerotilus）和羅爾斯通菌屬（Ralstonia），其中紅細(xì)菌屬（7.68%）、噬氫菌屬（3.73%）和聚球藻屬（3.40%）占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì).除了擬浮絲藻屬是一類水華藍(lán)藻，以上提到的其他主要優(yōu)勢(shì)菌屬都是有益菌類.綜合這些結(jié)果，發(fā)現(xiàn)魚菜共生模式下環(huán)境微生物的主要優(yōu)勢(shì)菌屬是聚球藻屬、hgcI_clade、CL500-29_marine_group、芽孢桿菌屬和分支桿菌屬等，空心菜根系微生物群落中主要優(yōu)勢(shì)菌屬是紅細(xì)菌屬、噬氫菌屬和聚球藻屬等.研究結(jié)果表明空心菜生物浮床能夠有效改善養(yǎng)殖環(huán)境中的微生態(tài)平衡.

表3 各樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門類及相對(duì)豐度（%）Table 3 Advantage bacterial phyla and the relative abundance of each sample （%）

2.4 氮循環(huán)細(xì)菌

根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌分類手冊(cè)（第九版）》［19］中對(duì)硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌的分類和描述，本次研究中主要發(fā)現(xiàn)了2類硝化細(xì)菌菌屬即亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）和硝化螺菌屬（Nitrospira）和4類反硝化細(xì)菌菌屬即假單胞菌屬（Pseudomonas）、副球菌屬（Paracoccus）、芽孢桿菌屬和噬氫菌屬（表4）.根據(jù)研究結(jié)果可知實(shí)驗(yàn)組硝化細(xì)菌的相對(duì)豐度高于對(duì)照組，分別為0.786%和0.420%，尤其是實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的沉積物微生物群落中含有大量的硝化細(xì)菌，分別為0.783%和0.419%；實(shí)驗(yàn)組的反硝化細(xì)菌的相對(duì)豐度也高于對(duì)照組，分別為4.973%和4.407%；空心菜根系微生物群落中含有大量的反硝化細(xì)菌（6.679%）.這些結(jié)果表明沉積物中的硝化細(xì)菌的含量比水環(huán)境中硝化細(xì)菌的含量高，沉積物中的反硝化細(xì)菌的含量比水環(huán)境中反硝化細(xì)菌的含量低.研究結(jié)果還表明空心菜生物浮床可以有效地提高養(yǎng)殖環(huán)境中硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌的含量，尤其是反硝化細(xì)菌，進(jìn)而有利于保持較好的養(yǎng)殖環(huán)境.

圖2 各樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬及其相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of the predominant genera in the samples

表4 氮循環(huán)細(xì)菌的組成及相對(duì)豐度（%）Table 4 The composition and relative abundance of nitrogen cycle bacteria （%）

2.5 微生物群落與環(huán)境因子之間的關(guān)系

為研究微生物群落與環(huán)境因子之間的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)將優(yōu)勢(shì)微生物群落與環(huán)境因子進(jìn)行了冗余分析（RDA），如圖3.

研究結(jié)果表明空心菜根系的優(yōu)勢(shì)菌落紅細(xì)菌屬、噬氫菌屬、Meganema、紅芽生菌屬、Shinella、玫瑰彎菌屬和球衣菌屬等與DO和硝酸鹽呈正相關(guān)關(guān)系，與亞硝酸鹽和TAN呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系.紅細(xì)菌屬與TN呈負(fù)相關(guān)關(guān)系.聚球藻屬和分支桿菌屬與所有的水質(zhì)因子之間的相關(guān)性都很弱.芽孢桿菌屬和羅爾斯通菌屬與DO、硝酸鹽和亞硝酸鹽呈正相關(guān)關(guān)系，與 TN和 TAN之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系.擬浮絲藻屬和Dechloromonas與TN和TAN呈正相關(guān)關(guān)系，與DO和硝酸鹽呈負(fù)相關(guān)關(guān)系.

hgcI_clade、CL500-29_marine_group和Polynucleobacter與亞硝酸鹽和TAN呈正相關(guān)關(guān)系，與DO和硝酸鹽呈負(fù)相關(guān)關(guān)系.

圖3 優(yōu)勢(shì)菌屬和環(huán)境因子的 RDA排序圖Fig.3 RDA diagram of predominant genera and environmental factors

3 討論

眾多研究都表明生物浮床能夠有效地去除水體中的污染物.有植物系統(tǒng)對(duì)廢水中的總氮、BOD、SS、氨氮和重金屬等的去除能力明顯高于無(wú)植物系統(tǒng)［20］，且生物浮床處能夠大幅降低污水中的氨氮和總磷等污染物［11-14,21］.大量研究表明空心菜生物浮床能夠有效去除水體中的含氮化合物等污染物質(zhì)［22-24］.本研究也表明空心菜生物浮床能夠有效降低水環(huán)境中的總氮、亞硝酸鹽和總氨氮的濃度，但本研究還發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖過(guò)程中含氮化合物會(huì)不斷積累［25］，需要及時(shí)調(diào)節(jié)水質(zhì)，保證健康養(yǎng)殖.

已有研究發(fā)現(xiàn)生物浮床會(huì)降低養(yǎng)殖水體中的溶解氧含量.由于生物浮床覆蓋水面，阻礙了氧氣的水溶作用，并降低了藻類的光合作用，導(dǎo)致水體“氧源”的減少［22］，同時(shí)植物根系的呼吸作用及根際微生物的硝化與反硝化作用會(huì)消耗大量氧氣［26］.但也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)生物浮床覆蓋率較低（≤20%）時(shí)，生物浮床對(duì)水體溶解氧濃度的影響不顯著［27-28］，覆蓋率為7.5%的空心菜生物浮床對(duì)池塘整體的溶氧水平無(wú)顯著影響［29］.本研究的結(jié)果與黃海平［24］的研究結(jié)果一致，都發(fā)現(xiàn)魚菜共生系統(tǒng)中水體的溶解氧濃度與對(duì)照組無(wú)顯著差異，但卻有所增加，這在生產(chǎn)應(yīng)用等方面具有重要意義.原因可能是在低覆蓋率（3.5%）條件下，空心菜生物浮床有效改善了養(yǎng)殖環(huán)境中的微生態(tài)平衡，這些微生物的變化最終產(chǎn)生了一種“綜合效應(yīng)”，有效地改善了養(yǎng)殖環(huán)境，促使水體中溶解氧含量增加以及含氮化合物濃度降低.

本研究發(fā)現(xiàn)魚菜共生模式下養(yǎng)殖水環(huán)境中微生物具有高豐富度和低多樣性，沉積物中微生物具有高豐富度和高多樣性，而且有益微生物明顯提高.本研究中養(yǎng)殖環(huán)境中有益微生物主要有聚球藻屬、CL500-29_marine_group、hgcI_clade、芽孢桿菌屬和分支桿菌屬等，空心菜根系微生物菌落中還有大量的有益微生物如紅細(xì)菌屬、噬氫菌屬和聚球藻屬等，這些微生物都是有益的優(yōu)勢(shì)菌屬.聚球藻屬是一類原核超微藻類，是初級(jí)生產(chǎn)力的主要參與者和貢獻(xiàn)者，在生態(tài)系統(tǒng)的光合作用、碳循環(huán)及食物鏈中具有重要作用［30］.芽孢桿菌屬和分支桿菌屬是以多環(huán)芳烴（PAHs）為唯一碳源的微生物［31］，且芽孢桿菌屬還兼具反硝化作用.菌群結(jié)構(gòu)組成表明實(shí)驗(yàn)組的芽孢桿菌屬的相對(duì)豐度高于對(duì)照組，RDA分析表明芽孢桿菌屬與DO、硝酸鹽和亞硝酸鹽之間呈正相關(guān)關(guān)系，與TN和 TAN之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，推測(cè)芽孢桿菌屬可能通過(guò)降解水體中的碳源污染物和反硝化作用，促進(jìn)養(yǎng)殖環(huán)境的氮循環(huán)等，并與環(huán)境因子相互影響，提高水體DO，改善養(yǎng)殖環(huán)境.hgcI_clade具有很強(qiáng)的吸收碳水化合物和富氮化合物的遺傳能力［32］，并耐受較低的DO濃度［33］，還能利用低溫水中的低濃度溶解有機(jī)碳，而CL500-29_marine_ group能夠有效利用多種形式的碳化合物［34］.菌群結(jié)構(gòu)組成表明實(shí)驗(yàn)組的hgcI_clade和CL500-29_marine_group的相對(duì)豐度低于對(duì)照組， RDA分析表明hgcI_clade和CL500-29_ marine_group與亞硝酸鹽和TAN呈正相關(guān)關(guān)系，與DO和硝酸鹽呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，推測(cè)hgcI_clade和CL500-29_marine_group通過(guò)促進(jìn)碳循環(huán)和氮循環(huán)等，并與環(huán)境因子相互影響，改善養(yǎng)殖環(huán)境.紅細(xì)菌屬是一類高效凈化水質(zhì)的光合細(xì)菌，兼具反硝化作用［35］，噬氫菌屬是一類反硝化細(xì)菌.菌群結(jié)構(gòu)組成表明實(shí)驗(yàn)組空心菜根系微生物中含有大量的紅細(xì)菌屬和噬氫菌屬，且RDA分析表明紅細(xì)菌屬和噬氫菌屬與DO和硝酸鹽呈正相關(guān)關(guān)系，與TAN和亞硝酸鹽呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，而且紅細(xì)菌屬還與TN呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，推測(cè)紅細(xì)菌屬和噬氫菌屬可能通過(guò)光合作用、硝化作用和反硝化作用等促進(jìn)養(yǎng)殖環(huán)境的氮循環(huán)等，并與環(huán)境因子相互影響，改善養(yǎng)殖環(huán)境.本研究還發(fā)現(xiàn)空心菜生物浮床可以有效地提高養(yǎng)殖環(huán)境中硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌的含量，尤其在植物根系存在大量的反硝化細(xì)菌.氨氮可在富氧區(qū)被硝化細(xì)菌以硝化作用氧化為硝態(tài)氮，而硝態(tài)氮?jiǎng)t在缺氧區(qū)中被反硝化細(xì)菌以反硝化作用還原為分子態(tài)氮而進(jìn)入大氣中［36］.生物浮床的覆蓋區(qū)存在“富氧—厭氧微環(huán)境”區(qū)，可為微生物的活動(dòng)提供有利條件［37-38］，使氮循環(huán)細(xì)菌中的不同類型細(xì)菌能夠同時(shí)存在，促進(jìn)水體氮循環(huán)［39］.“富氧—厭氧微環(huán)境”區(qū)的同時(shí)或交替存在還可促進(jìn)根區(qū)微生物的生長(zhǎng)和繁殖，從而提高生物浮床系統(tǒng)對(duì)污染物的去除效率［40-41］.正是在這些優(yōu)勢(shì)微生物的“綜合效應(yīng)”下，魚菜共生模式下水環(huán)境中溶解氧含量相對(duì)較高，含氮化合物濃度相對(duì)較低，促使養(yǎng)殖環(huán)境更優(yōu)良，更有利于健康養(yǎng)殖.

本研究中魚菜共生模式下環(huán)境微生物主要是優(yōu)勢(shì)菌門是變形菌門和藍(lán)細(xì)菌門、擬桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、厚壁菌門、梭桿菌門、酸桿菌門、浮霉菌門和綠菌門，主要菌屬是聚球藻屬、芽孢桿菌屬和分支桿菌屬等，空心菜根系微生物菌落中主要菌屬是紅細(xì)菌屬、噬氫菌屬和聚球藻屬等.本研究的結(jié)果與其他研究者的結(jié)果存在一定的差異.眾多學(xué)者研究表明淡水水體中微生物主要屬于變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、藍(lán)細(xì)菌門、疣微菌門和浮霉菌門等［42-44］，優(yōu)勢(shì)菌屬為嗜胞菌屬（Cytophaga）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、伯克氏菌屬（Burkholderia）等［42］，植物根際優(yōu)勢(shì)菌屬以假單胞菌屬、微球菌屬（Micrococcus）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）等微生物為主［45-47］.導(dǎo)致存在差異的主要原因是水體微生物群落結(jié)構(gòu)受自然環(huán)境和水體環(huán)境因子如光照、溫度、pH值、水流、風(fēng)速等條件的影響［48］，水生植物根際微生物多樣性受植物類型、植物長(zhǎng)勢(shì)、水體環(huán)境因子等多種因素的相互影響［49］，另外技術(shù)進(jìn)步和研究方法也會(huì)導(dǎo)致差異的出現(xiàn)［48］.

4 結(jié)論

采用宏基因組學(xué)測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)手段，分析了環(huán)境微生物和根系微生物群落的多樣性.研究結(jié)果表明魚菜共生模式下優(yōu)勢(shì)菌門是變形菌門、藍(lán)細(xì)菌門、擬桿菌門、放線菌門、綠彎菌門和厚壁菌門等，主要菌屬是聚球藻屬、hgcI_clade、CL500-29_marine_group、芽孢桿菌屬和分支桿菌屬等；空心菜根系微生物群落中最豐富的優(yōu)勢(shì)菌門是變形菌門和藍(lán)細(xì)菌門，主要菌屬是紅細(xì)菌屬、噬氫菌屬和聚球藻屬等.研究結(jié)果還表明低覆蓋率（3.5%）的空心菜生物浮床能夠增加水體的溶解氧含量，降低水體中含氮化合物的濃度和改善養(yǎng)殖環(huán)境中的微生態(tài)平衡，提高有益菌和氮循環(huán)細(xì)菌的含量.

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Influence on water quality and microbial diversity in fish pond by Ipomoea aquatica floating-bed.

LI Jian-zhu， HOU Jie， ZHANG Peng-fei， LIU Yao-quan， XIA Run-hong， MA Xu-fa*（Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070，China）. China Environmental Science， 2016，36（10）：3071～3080

In order to investigate the influence on water quality and microbial diversity in intensive fish pond by Ipomoea aquatica floating-bed， and the composition and diversity of microbial communities in the samples were researched based on high throughput sequencing of 16S rRNA gene. The results revealed that the dominant bacteria were phyla Proteobacteria， Cyanobacteria， Bacteroidetes， Actinobacteria， Chloroflexi and Firmicutes， the dominant bacteria were genera Synechococcus， hgcI_clade， CL500-29_marine_group， Bacillus and Mycobacterium in the Aquaponics System，and the most dominant bacteria of rhizosphere microorganisms were phyla Proteobacteria and Cyanobacteria， the dominant bacteria were genera Rhodobacter， Hydrogenophaga and Synechococcus. Moreover， the results also showed that low coverage （3.5%） of Ipomoea aquatica floating-bed increased the dissolved oxygen content and reduced the concentration of nitrogen compounds， and improved micro-ecological balance and increased the content of the beneficial bacteria and nitrogen cycle bacteria in aquaculture water body.

Ipomoea aquatica floating-bed；environmental microbial diversity；water quality；16S rDNA

X171.1，S917.1

A

1000-6923（2016）10-3071-10

李建柱（1990-），男，湖北孝感人，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究生，主要研究方向?yàn)轲B(yǎng)殖水環(huán)境生物監(jiān)測(cè)與調(diào)控.

2016-02-18

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2012BAD25B05）和湖北省自然科學(xué)基金（2013CFA095）資助

* 責(zé)任作者， 副教授， xufama@mail.hzau.edu.cn