邊忠博，孫如一，王磊，張一，楊柳，陳宇飛*

(1.吉林工商學(xué)院 食品工程學(xué)院，長(zhǎng)春 130507；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118)

3 LAMP技術(shù)在動(dòng)物源性食品病原菌檢測(cè)中的應(yīng)用

4 LAMP技術(shù)在動(dòng)物源性成分檢測(cè)中的應(yīng)用

LAMP技術(shù)在動(dòng)物源性食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用

邊忠博1，孫如一2，王磊1，張一1，楊柳1，陳宇飛1*

(1.吉林工商學(xué)院 食品工程學(xué)院，長(zhǎng)春 130507；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118)

近年來(lái)，動(dòng)物源性食品安全問(wèn)題時(shí)有發(fā)生，急需發(fā)展快速、高效的檢測(cè)技術(shù)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種新的體外擴(kuò)增特異DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，因其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，可以在動(dòng)物源性食品安全檢測(cè)中應(yīng)用。文章針對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在動(dòng)物源性食品病原菌檢測(cè)、動(dòng)物源性成分檢測(cè)兩個(gè)方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述，分析LAMP技術(shù)的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，旨在為更好地解決動(dòng)物源性食品安全問(wèn)題提供幫助。

動(dòng)物源性食品；LAMP技術(shù)；致病菌；成分；檢測(cè)

1 概述

動(dòng)物源性食品是指來(lái)源于豬、牛、羊、禽、馬屬動(dòng)物、犬、兔、蜜蜂及水產(chǎn)類(lèi)動(dòng)物的可供人食用的肉、乳、蛋及制品和副產(chǎn)品[1]。隨著人們生活水平的提高和膳食結(jié)構(gòu)的改變，動(dòng)物源性食品的消費(fèi)量日益增大[2]。近年來(lái)，動(dòng)物源性食品安全問(wèn)題時(shí)有發(fā)生，此問(wèn)題已受到國(guó)家政府的重視，引起廣大人民群眾的高度關(guān)注和共識(shí)[3]。

本文針對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在動(dòng)物源性食品病原菌檢測(cè)、動(dòng)物源性成分檢測(cè)兩個(gè)方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述，分析LAMP技術(shù)在動(dòng)物源性食品安全檢測(cè)中應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)，旨在為更好地解決動(dòng)物源性食品安全問(wèn)題提供幫助。

2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新的體外擴(kuò)增特異脫氧核糖核酸片段的分子生物學(xué)技術(shù)，是由Notomi等于2000年建立的[4]。

LAMP技術(shù)主要針對(duì)靶基因序列的6個(gè)不同區(qū)域，設(shè)計(jì)1對(duì)外引物F3和B3、1對(duì)內(nèi)引物FIP和BIP，加入具有鏈置換作用的DNA聚合酶，在60～65 ℃范圍內(nèi)，對(duì)DNA 片段特異性基因序列上的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生白色的焦磷酸鎂沉淀[5]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)因具有特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快、檢測(cè)靈敏度高、可實(shí)現(xiàn)更加清晰的可視化檢測(cè)、可脫離儀器、實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[6]，目前已用于動(dòng)物源性食品病原菌檢測(cè)、動(dòng)物源性成分檢測(cè)等領(lǐng)域。

3 LAMP技術(shù)在動(dòng)物源性食品病原菌檢測(cè)中的應(yīng)用

對(duì)人體危害嚴(yán)重的動(dòng)物源性食品病原菌主要有肉毒桿菌、沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌、布魯氏菌、金黃色葡萄球菌等[7]。

3.1 肉毒桿菌檢測(cè)

肉毒桿菌作為一種致病菌，能引起中毒癥，由于它具有厭氧生長(zhǎng)、低溫生長(zhǎng)產(chǎn)毒的特點(diǎn)，使其在日前普及的真空包裝、冷凍食品及罐裝食品中具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，從而成為這類(lèi)食品中毒的主要原因之一[8]。

陳宇飛等對(duì)經(jīng)過(guò)加工的熟肉類(lèi)寵物食品進(jìn)行研究，建立了寵物食品中肉毒桿菌LAMP檢測(cè)方法，建立的LAMP反應(yīng)體系只擴(kuò)增肉毒桿菌基因，特異性好，體系的最佳反應(yīng)溫度為64 ℃，最佳反應(yīng)時(shí)間為60 min，最低檢測(cè)濃度為0.0001 pg/μL，比PCR高出10倍。

3.2 沙門(mén)氏菌檢測(cè)

沙門(mén)氏菌是公共衛(wèi)生學(xué)上有重要意義的人畜共患病原菌之一，可導(dǎo)致人類(lèi)感染和食源性中毒[9]。

寵心怡等應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)建立了一種快速、高效、靈敏的肉中沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度為普通PCR的100倍，達(dá)到了9.8×102cfu/mL。

唐夢(mèng)君等[10]建立了檢測(cè)雞蛋中沙門(mén)氏菌的LAMP方法，檢測(cè)沙門(mén)氏菌純培養(yǎng)物的靈敏度為1.04×102cfu/mL，應(yīng)用該方法對(duì)揚(yáng)州市場(chǎng)上銷(xiāo)售的雞蛋沙門(mén)菌檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相符，并且檢測(cè)特異性強(qiáng)，耗時(shí)短。

王羽等[11]采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)肉制品中的沙門(mén)氏菌，對(duì)香腸、豬肉、牛肉、羊肉、雞肉等制品進(jìn)行檢測(cè)，檢出率達(dá)91.6%，與國(guó)標(biāo)相比，符合率為93.8%。

3.3 單增李斯特菌檢測(cè)

單增李斯特菌是一種人畜共患食源性致病菌，可使人畜患腦膜炎、心肌炎、敗血癥、早產(chǎn)等疾病，危害較大[12]。

陳洵等[13]研究了環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)生肉及熟肉制品中的致病微生物，建立的檢測(cè)試劑盒可檢出肉制品中的單增李斯特菌，對(duì)其他近源菌株檢測(cè)呈陰性結(jié)果，檢出限達(dá)1.81×103cfu/mL。

3.4 布魯氏菌檢測(cè)

布魯氏菌病作為一種人獸共患傳染病而廣泛分布，既可感染人類(lèi)，又可感染經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，如豬、羊、牛、鹿等，對(duì)人或牲畜的健康、國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及國(guó)家安全等都能構(gòu)成嚴(yán)重的威脅[14]。

謝文萍等[15]應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，針對(duì)布魯氏菌保守基因設(shè)計(jì)LAMP引物，通過(guò)濁度法對(duì)LAMP反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示：濁度法的最低檢測(cè)限為4.36 fg/μL，靈敏度高于普通PCR的最低檢出限4.36 pg/μL。

藺國(guó)珍[16]建立了可以快速檢測(cè)布魯氏菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法，通過(guò)對(duì)血樣和奶樣進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)出了6個(gè)種的布魯氏菌病原，最低檢測(cè)限度達(dá)到了9 fg/μL，與PCR方法進(jìn)行比較，高出了10倍。

3.5 金黃色葡萄球菌檢測(cè)

金黃色葡萄球菌是人和動(dòng)物的重要病原菌之一，同時(shí)也是食物中毒的常見(jiàn)致病菌之一[17]。

蔡克周等[18]采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，檢測(cè)豬血中金黃色葡萄球菌，金黃色葡萄球菌通過(guò)LAMP方法檢測(cè)，靈敏度達(dá)到了8.7 cfu/mL，對(duì)豬血中金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)，檢出限達(dá)到8.7×102cfu/mL，而利用PCR法進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為8.7×103cfu/mL，該方法具有較高的特異性和敏感性。

徐義剛等[19]建立了食品中金黃色葡萄球菌DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法，并對(duì)958份雞肉制品、牛肉制品、奶粉、雞蛋制品等樣品、人工污染樣品進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)污染食品的金黃色葡萄球菌的檢測(cè)靈敏度為42 cfu/mL，40～60 min內(nèi)即可完成檢測(cè)。

3.6 LAMP技術(shù)用于動(dòng)物源性食品病原菌檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)

LMAP技術(shù)用于食品病原菌檢測(cè)，克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法操作繁雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)，檢測(cè)時(shí)間通常可在60 min內(nèi)，最長(zhǎng)90 min 內(nèi)完成，如果在反應(yīng)中添加了環(huán)引物，那么反應(yīng)時(shí)間將會(huì)縮短至30～45 min。與PCR檢測(cè)方法相比，LAMP技術(shù)用于食品病原菌檢測(cè)，具有更高的靈敏度。同時(shí)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)因?yàn)椴僮骱?jiǎn)單，而且不需要配備昂貴的儀器設(shè)備，在使用配套試劑盒時(shí)，僅需要配置一臺(tái)水浴鍋即可完成檢驗(yàn)，特別適合食品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)、出入境、邊遠(yuǎn)地區(qū)進(jìn)行動(dòng)物源性病原菌檢測(cè)。

4 LAMP技術(shù)在動(dòng)物源性成分檢測(cè)中的應(yīng)用

由于肉、奶等生肉及熟肉類(lèi)食品中“摻雜使假”的投訴事件不斷上升，瘋牛病的傳播風(fēng)險(xiǎn)也在不斷加大，作為保障食品安全、維護(hù)消費(fèi)者利益的重要技術(shù)手段，食品和飼料中動(dòng)物源性成分的定性或定量檢測(cè)技術(shù)已成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[20]。

4.1 牛源性成分檢測(cè)

徐淑菲等[21]建立了牛源性成分LAMP檢測(cè)方法，試驗(yàn)結(jié)果表明：該方法靈敏度比PCR方法高100倍，達(dá)到5.408×10-2μg/μL，反應(yīng)時(shí)間短，最快在10 min即可完成。

冼鈺茵等[22]建立了肉及肉制品中牛源性成分的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，對(duì)市售的9種生牛及美味孜然牛肉、芝麻牛肉、手撕風(fēng)干牛肉3種熟肉類(lèi)制品進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，結(jié)果表明：該方法生肉及熟肉類(lèi)制品中牛源性成分檢測(cè)都具有高靈敏度、高特異性。

4.2 羊源性成分檢測(cè)

徐淑菲等根據(jù)羊cytB基因設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，動(dòng)物GenieⅡ等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)，以L(fǎng)AMP檢測(cè)方法為基礎(chǔ)，建立了檢測(cè)羊源性成分的LAMP方法，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到5.928×10-3μg/μL。

4.3 狐貍源性成分檢測(cè)

劉少寧等[23]建立了一種能夠快速區(qū)分出綿羊肉中摻入狐貍源性成分的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法，可檢測(cè)出摻假率為1.0%的羊肉制品，最低檢測(cè)濃度為2×10-4ng/μL。

4.4 雞、鴨源性成分檢測(cè)

楊麗霞等[24]建立了生肉及熟肉制品中雞、鴨源性成分的特異性基因LAMP可視化快速檢測(cè)方法，最低檢出限為1 pg，對(duì)肉制品中目標(biāo)物檢測(cè)的檢出限可達(dá)到0.01%。

4.5 豬源性成分檢測(cè)

李向麗等[25]基于LAMP法對(duì)市售羊肉片、羊肉卷、羊肉串進(jìn)行了豬源性成分、鴨源性成分和羊源性成分檢測(cè)分析，檢測(cè)靈敏度達(dá)0.5%。

4.6 LAMP技術(shù)用于動(dòng)物源性成分檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)

LAMP檢測(cè)方法中核酸擴(kuò)增結(jié)果與常規(guī)的PCR檢測(cè)方法進(jìn)行比較，具有更高的特異性。因?yàn)樵诜磻?yīng)體系中添加了鈣黃綠素，反應(yīng)后可產(chǎn)生綠色的熒光，可以實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更清晰。LAMP技術(shù)開(kāi)發(fā)的配套試劑盒，使得動(dòng)物源性成分檢測(cè)更便捷、更適合在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行快速檢測(cè)。

5 結(jié)語(yǔ)

在動(dòng)物源性食品病原菌檢測(cè)和動(dòng)物源性成分檢測(cè)中應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，并開(kāi)發(fā)配套試劑盒，可以減少檢測(cè)時(shí)間，使檢測(cè)過(guò)程更簡(jiǎn)便，突破動(dòng)物源性食品檢測(cè)靈敏度低、檢測(cè)周期長(zhǎng)、儀器設(shè)備昂貴等技術(shù)瓶頸，可廣泛應(yīng)用于出入境檢驗(yàn)檢疫局、食品安全監(jiān)管部門(mén)、基層等進(jìn)行動(dòng)物源性食品安全檢測(cè)。

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ApplicationofLAMPTechniqueinAnimalDerivedFoodSafetyDetection

BIAN Zhong-bo1, SUN Ru-yi2, WANG Lei1, ZHANG Yi1, YANG Liu1, CHEN Yu-fei1*

(1.School of Food Engineering, Jilin Business and Technology College, Changchun 130507, China;2.College of Life Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

The problem of animal derived food safety has occurred occasionally in recent years.The fast and efficient detection technique is in urgent need.The loop-mediated isothermal amplification is a new molecular biological technique which can amplify specific DNA fragments in vitro.This technique can be applied in animal derived food safety detection because of its strong specificity, high sensitivity and fast testing speed.The application of LAMP in animal derived food pathogenic bacteria and animal derived ingredients detection are summarized.The advantages of application of LAMP technique are analyzed, which can provide help for solving the problem of animal derived food safety better.

animal derived food；LAMP technique；pathogenic bacteria；component；detection

TS207.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.11.028

1000-9973(2017)11-0127-03

2017-05-20 *通訊作者

中國(guó)農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2016開(kāi)放基金；吉林省科技廳2015年重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(20150204064NY)；吉林工商學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金項(xiàng)目([2016]第005號(hào))

邊忠博(1984-)，男，吉林長(zhǎng)春人，講師，研究方向：食品加工及檢測(cè)；

陳宇飛(1968-)，男，吉林松源人，教授，研究方向：食品安全檢測(cè)。