王 琴，趙啟祖，徐 璐，張乾義，鄒興啟，朱元源，寧宜寶，李 翠，范學(xué)政

（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，OIE豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

研究進(jìn)展

中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所OIE豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室豬瘟研究進(jìn)展

王 琴，趙啟祖，徐 璐，張乾義，鄒興啟，朱元源，寧宜寶，李 翠，范學(xué)政

（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，OIE豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國(guó)家豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室是由農(nóng)業(yè)部2002年公布的第一批國(guó)家參考實(shí)驗(yàn)室，2017年6月1日，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）確認(rèn)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所豬瘟實(shí)驗(yàn)室成為新的OIE豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室，該實(shí)驗(yàn)室是國(guó)內(nèi)最早開(kāi)展豬瘟（Classical Swine Fever，CSF）研究的權(quán)威實(shí)驗(yàn)室之一。按照國(guó)家重大動(dòng)物疫病防控的需求以及OIE 參考實(shí)驗(yàn)室職能的要求，該實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)承擔(dān)了近22項(xiàng)國(guó)家和省部級(jí)的研究課題，研究經(jīng)費(fèi)達(dá)2 000萬(wàn)元。開(kāi)展了我國(guó)豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSF V）的分子流行病學(xué)研究、豬瘟流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和信息系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)、豬瘟新型診斷試劑的研發(fā)、豬瘟標(biāo)準(zhǔn)品和參照品的制備和標(biāo)定、豬瘟新型疫苗的研發(fā)、相關(guān)基礎(chǔ)研究和豬瘟綜合防控和凈化技術(shù)研究，取得了重要的進(jìn)展。簡(jiǎn)要總結(jié)如下：

1 我國(guó)豬瘟流行病學(xué)及數(shù)據(jù)庫(kù)研究

豬瘟病毒分子流行病學(xué)研究的科學(xué)意義，在于實(shí)時(shí)跟蹤C(jī)SFV的變異特征及抗原性變異程度，監(jiān)測(cè)新的CSFV流行毒株的情況和疫苗對(duì)流行毒株的有效性。通過(guò)分析我國(guó)自1979年到2016獲得和收集的868條E2基因主要抗原區(qū)域序列（190 bp）(含中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)的49條)，中國(guó)流行的CSFV分屬為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三個(gè)基因型，1.1、2.1、2.2、2.3 和3.4五個(gè)基因亞型。經(jīng)分析中國(guó)大陸的819條E2基因序列，74.24%屬于基因Ⅱ型，其中2.1亞型為499條，占60.93%；1.1亞型為211條，占25.76%；其他為少量的2.2和2.3亞型分別為93條（11.36%）和16條（1.95%）；中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)存在基因Ⅲ型。全國(guó)各省市自治區(qū)均存在基因Ⅱ型，表明基因Ⅱ型在中國(guó)CSF流行中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，屬優(yōu)勢(shì)基因型。序列比對(duì)分析研究還發(fā)現(xiàn)中國(guó)CSFV流行株基因組在37 年間處于穩(wěn)定狀態(tài)。監(jiān)測(cè)結(jié)果還表明，到目前為止，中國(guó)大陸一直沒(méi)有監(jiān)測(cè)到基因Ⅲ型的傳入與流行，但周邊國(guó)家及中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)存在其他亞型毒株，如韓國(guó)存在3.2亞型、泰國(guó)存在3.3亞型、中國(guó)臺(tái)灣和日本存在3.4亞型毒株。因此，要警惕周邊國(guó)家及地區(qū)的新亞型流行毒株傳入我國(guó)大陸。

我們采用上述CSFV流行病學(xué)數(shù)據(jù)，與數(shù)據(jù)庫(kù)、GIS（地理信息系統(tǒng)）、生物信息學(xué)技術(shù)相結(jié)合，創(chuàng)建了我國(guó)第一個(gè)豬瘟流行病學(xué)信息系統(tǒng)（CSFinfo），包含1 000株中國(guó)流行毒株、868條CSFV E2基因序列和其他序列，成為全球繼德國(guó)之后第二個(gè)擁有這種數(shù)據(jù)庫(kù)的國(guó)家。對(duì)CSFV流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供了重要技術(shù)平臺(tái)，為政府提供可靠的疫情資料。

2 豬瘟診斷技術(shù)

準(zhǔn)確、特異和快速的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)是豬瘟防控的重要手段，病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)方面，我國(guó)OIE豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室采用自主研發(fā)的CSFV E2單克隆抗體優(yōu)化和完善了CSFV分離培養(yǎng)技術(shù)、熒光抗體檢測(cè)技術(shù)、免疫過(guò)氧化物酶檢測(cè)技術(shù)和體外病毒中和試驗(yàn)；研制了CSFV通用熒光RT-PCR診斷試劑盒、CSFV MGB鑒別熒光RTPCR診斷試劑盒和CSFV套式RT-nPCR 診斷試劑盒3種CSFV核酸診斷試劑盒，用于CSF疫情監(jiān)測(cè)、強(qiáng)弱毒鑒別診斷、分子流行病學(xué)調(diào)查；研制了豬瘟兔化弱毒疫苗和牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)試劑盒，用于疫苗中間產(chǎn)品效力檢驗(yàn)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法及原材料中牛病毒性腹瀉病毒的檢測(cè)，為疫苗質(zhì)量安全提供技術(shù)保障；還研發(fā)了CSFV QuantiGene ViewRNA原位雜交檢測(cè)方法，可用于CSFV RNA在易感細(xì)胞中的復(fù)制規(guī)律進(jìn)行研究和臨床診斷。所有病毒核酸診斷試劑盒的敏感性均高于商品化的國(guó)外ELISA抗原檢測(cè)試劑盒，特異性好。只要根據(jù)CSF的臨床特征，合理地采用適當(dāng)?shù)姆椒ǎ耆梢酝ㄟ^(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷達(dá)到確診CSF的目的。

在我國(guó)，通過(guò)抗體水平的監(jiān)測(cè)來(lái)制定合理、有效的免疫程序是提高群體免疫水平的保證，也是評(píng)價(jià)疫苗免疫效果的重要技術(shù)手段。OIE豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室采用桿狀病毒表達(dá)的CSFV E2蛋白原創(chuàng)性研發(fā)的CSFV間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，較國(guó)外產(chǎn)品具有更高的敏感性、適用性和實(shí)用性，解決了長(zhǎng)期使用國(guó)外同類(lèi)產(chǎn)品費(fèi)用高昂的困境，更合適中國(guó)目前全面普免的抗體普查，是我國(guó)第一個(gè)獲得新獸藥證書(shū)的豬瘟抗體檢測(cè)ELISA制品；采用E2蛋白和自制的CSFV E2單克隆抗體原創(chuàng)性地研發(fā)了CSFV阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，解決了CSFV間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒特異性較差的問(wèn)題，同時(shí)敏感性高于同類(lèi)產(chǎn)品；隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將靈敏的化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)ELISA原理，建立了豬瘟病毒化學(xué)發(fā)光抗體檢測(cè)試劑盒，進(jìn)一步提升了豬瘟病毒ELISA技術(shù)的敏感性和特異性。采用上述E2單抗完善了OIE推薦的方法：豬瘟病毒熒光抗體病毒中和試驗(yàn)（Neutralization-immunofluorescence，NIF）和豬瘟病毒過(guò)氧化物酶聯(lián)中和 試 驗(yàn)（Neutralization peroxidaselinked antibody，NPLA）。

目前，我國(guó)OIE豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室不但建立、完善、使用并推廣OIE手冊(cè)確認(rèn)的豬瘟診斷技術(shù)，還自主研發(fā)了一系列的豬瘟新型診斷技術(shù)。建立了病毒標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)、血清標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)和單抗標(biāo)準(zhǔn)品庫(kù)，發(fā)布了2項(xiàng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，并制定了系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）。2009年至2016年，我實(shí)驗(yàn)室6次參加了OIE/歐盟CSF參考實(shí)驗(yàn)室（EUCSFRL）組織的來(lái)自42個(gè)國(guó)家50個(gè)實(shí)驗(yàn)室的CSF診斷能力比對(duì)試驗(yàn)（ILCT），達(dá)到歐盟標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)室已具備OIE要求的診斷能力，人員技術(shù)水平和操作技能也達(dá)到OIE要求。部分診斷方法被推薦為2011-2017年國(guó)家豬瘟免疫和監(jiān)測(cè)方案使用方法。

至此，我實(shí)驗(yàn)室在CSF診斷、疫情監(jiān)測(cè)、分子流行病學(xué)分析等所需的檢測(cè)方法已經(jīng)系統(tǒng)建立，突破了我國(guó)豬瘟診斷試劑長(zhǎng)期依賴進(jìn)口的狀態(tài)，標(biāo)志著我國(guó)的豬瘟診斷技術(shù)達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平，提升了中國(guó)CSF診斷技術(shù)在國(guó)際上的認(rèn)可，為其防控和凈化掃清了障礙。

3 其他研究進(jìn)展

近年來(lái)我實(shí)驗(yàn)室成功研發(fā)出了豬瘟傳代細(xì)胞疫苗，通過(guò)對(duì)C-株疫苗再評(píng)價(jià)研究，分子流行病學(xué)研究結(jié)合動(dòng)物免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了現(xiàn)用C-株疫苗對(duì)我國(guó)流行毒株（Ⅰ和Ⅱ型）能實(shí)施有效保護(hù)，來(lái)自英國(guó)APHA的數(shù)據(jù)顯示C-株疫苗對(duì)基因Ⅲ型也能提供完全保護(hù)，為我國(guó)繼續(xù)使用豬瘟兔化弱毒疫苗進(jìn)行全面免疫提供了重要科學(xué)依據(jù)，為堅(jiān)持我國(guó)政府制定的100%強(qiáng)制免疫策略奠定了科學(xué)理論基礎(chǔ)，否定了多年來(lái)提出的“由野毒株變異引起免疫失敗”的學(xué)術(shù)爭(zhēng)端。正在開(kāi)展DIVA疫苗和E2亞單位疫苗等新型疫苗的研究。

還在豬瘟慢性感染與免疫機(jī)制、豬瘟病毒和RNA在感染豬體內(nèi)的分布和C-株減毒分子機(jī)制等基礎(chǔ)研究方面取得了重要的進(jìn)展。闡明了感染與免疫的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了豬瘟病毒致弱的區(qū)域。

根據(jù)中國(guó)豬瘟流行特點(diǎn)，在國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃的支持下，對(duì)我國(guó)部分示范養(yǎng)豬場(chǎng)CSF凈化的成功先例表明，在我國(guó)目前豬病流行狀態(tài)下，在規(guī)?；i場(chǎng)和部分區(qū)域開(kāi)展CSF的凈化并逐步對(duì)其根除是完全可行的。構(gòu)建了符合我國(guó)國(guó)情規(guī)模化豬場(chǎng)的CSF凈化模式，制定了系列《規(guī)?；i場(chǎng)豬瘟凈化技術(shù)指南》、《集約化、規(guī)?；i場(chǎng)生物安全體系的實(shí)施方案》方案和指南，取得重要?jiǎng)?chuàng)新性成果，為規(guī)?；i場(chǎng)豬瘟凈化提供了技術(shù)措施。

2017-11-02）