張愛瓊，梁海英，曾智勇

（貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

新型豬圓環(huán)病毒（PCV3）在患有心臟和多系統(tǒng)性炎癥病豬中的首次鑒定

張愛瓊，梁海英，曾智勇*

（貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

豬圓環(huán)病毒可分為豬圓環(huán)病毒1型和2型（PCV1和PCV2），僅PCV2可感染致病。然而，2016年P(guān)lan等利用宏基因組測序技術(shù)，對3例伴有不明原因的心臟和多器官炎癥的豬組織樣品進(jìn)行研究時，首次發(fā)現(xiàn)并獲得了3株新型豬圓環(huán)病毒（PCV3）的全基因序列。

第1例樣品系美國密蘇里州患有厭食癥、體重下降和關(guān)節(jié)腫脹的仔豬，其中兩頭的病因得以查明，而另一頭有心肌炎病變的仔豬（3周齡）的病因無法解釋被用來作進(jìn)一步研究。2015年5月，將該豬的新鮮組織樣品送到明尼蘇達(dá)大學(xué)獸醫(yī)診斷實驗室，進(jìn)行細(xì)菌學(xué)和病毒學(xué)診斷處理。由于引起心臟病變的病因仍無法闡明，故利用病毒宏基因組測序?qū)π呐K和肺組織勻漿樣品進(jìn)行分析。將勻漿液通過15 000×g離心10 min，取上清經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，用核酸酶對上清中的核酸進(jìn)行降解，然后提取病毒核酸進(jìn)行隨機RTPCR，并用Klenow DNA聚合酶和具有簡并3`端的引物（GCCGACTAATGCGTAGTCNNNNNNNN）進(jìn)行擴增測序。所得序列經(jīng)生物信息學(xué)相關(guān)軟件比較分析后，篩選出50個與豬圓環(huán)病毒SFBeef及PorkNW2/USA/2009病毒極為相似的序列。之后，使用短序列片段設(shè)計的特異性引物擴增圓環(huán)病毒的完整DNA基因組，測序得到PCV3-US/MO2015（GenBank KX778720）。為了進(jìn)一步研究PCV3在感染豬心臟和肺組織中的存在情況，使用靶向PCV3探針進(jìn)行原位雜交，在心肌細(xì)胞中檢測出有大量PCV3的mRNA存在，在肺組織中未檢測到有PCV3的mRNA。

第2例樣品系2016年5月由美國明尼蘇達(dá)州送檢的9～10周齡且曾患有呼吸疾病和直腸脫垂的病死豬，將死豬心、肝、脾、肺作病例1同樣的處理后，進(jìn)行宏基因組測序分析。其中篩選出1 646個與圓環(huán)病毒SFBeef及PorkNW2/USA/2009病毒相似的序列，且已組裝成和PCV3-US/MO2015相似性達(dá)98.5%的核苷酸序列（2 000 bp錯配21對）。應(yīng)用相關(guān)引物擴增測序得到了PCV3-US/MN2016的完整基因組序列（GenBank KX898030）。

第3例樣品系2016年8月由南達(dá)科他州送檢的曾患有嚴(yán)重呼吸和神經(jīng)疾病的一頭19日齡豬的經(jīng)福爾馬林固定和未經(jīng)固定的組織樣品，相關(guān)樣品作病例1同樣的處理后，進(jìn)行宏基因組測序分析。所得序列經(jīng)相關(guān)軟件比較分析獲得了大小為1 783 bp的與PCV3基因組相同的拼接序列，空缺部分經(jīng)PCR擴增測序進(jìn)行了補充完善，最終獲得了大小為2 000 bp的PCV3-US/SD2016完整基因組序列（GenBank KX966193）。

上述PCV3感染豬的日齡在2～3周和9～10周之間，這表明仔豬在出生后不久就可能被感染，且不排除有垂直感染的可能。上述檢測樣品，通過特殊檢測首先排除了可引起小動脈炎、血管炎和非化膿性心肌炎的常見致病因子（如PCV2和PRRSV）和一些潛在致病因子。同時，宏基因組分析產(chǎn)生的結(jié)果與我們稱為PCV3的新型圓環(huán)病毒感染一致，所述PCV3的mRNA在發(fā)炎的心臟小動脈，分散的心肌細(xì)胞和炎癥細(xì)胞浸潤的相鄰心肌中被檢測到，其結(jié)果表明PCV3病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄與病例1的心臟病變之間可能存在一定的聯(lián)系。

三例樣品中既檢測到了PCV3的感染，也檢測到了其與豬星狀病毒（PAstV4）的共感染。因此，PAstV4可能單獨致病，但也可能與PCV3共感染致病。PAstV4，在2011年首次在匈牙利的豬糞中測出，是一組多樣的相關(guān)病毒，可以在70%的歐洲腹瀉豬的糞便中檢測到，并且可能與來自明尼蘇達(dá)州的豬的腹瀉有關(guān)。此外，在來自克羅地亞的健康豬血液中也檢測到PAstV4；最近在美國患有急性呼吸道疾病的豬鼻拭子中也發(fā)現(xiàn)了類似的星狀病毒（75%的核苷酸序列相似）。雖然PAstV4在健康和腹瀉豬中是高度普遍的腸道感染，但PAstV4作為全身血液感染并與其他感染因子如PCV3混合感染，就如同上述3例樣品一樣，也是與臨床特征吻合可信的病原體。

深度測序結(jié)果表明PCV3在心臟組織中是存在病毒復(fù)制現(xiàn)象的。盡管病例1中的心肌炎和小動脈炎的病因仍不清楚，并且在心臟組織中也檢測到其他病毒的核酸，但在病變附近復(fù)制的新型圓環(huán)病毒的發(fā)現(xiàn)，提高了PCV3病毒可能在臨床致病過程發(fā)揮作用的可能性。PCV3在其他2個具有心臟和多系統(tǒng)炎癥的特征的樣品中的檢出，進(jìn)一步表明PAstV4可能加劇與其協(xié)同致病的作用。根據(jù)最近報道的中國馬蹄蝠圓環(huán)病毒基因組(GenBank KJ641723)來看，蝙蝠可能被認(rèn)為是PCV3的原始來源。

為了更好地了解PCV3在豬群中的分布和流行以及其在疾病中的作用，需要進(jìn)一步開展更為廣泛的研究。

國家自然科學(xué)基金項目“豬圓環(huán)病毒iDNA標(biāo)記疫苗及其免疫應(yīng)答效果的研究”

張愛瓊（1990—）女，研究方向：動物傳染病病原分子生物學(xué)。E-mail：1147415844@qq.com

*通訊作者： 曾智勇（1978—），男，教授，從事動物傳染病病原分子生物學(xué)研究：E-mail：zyzeng@gzu.edu.cn

2017-05-17）