□ 劉 麗 趙媛媛 李 飛 張耀廣 柴彥兵 石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司

LC-MS檢測乳制品中金霉素、土霉素、四環(huán)素的方法

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本文建立了乳制品中金霉素、土霉素、四環(huán)素的LC-MS測定方法。樣品用濃度為0.1 mol/L的Na2Ed TAMcllvaine緩沖液（pH=4±0.05）提取，經(jīng)過濾和離心后，上清液用HLB固相萃取柱凈化，用LC-MS測定，C18毛細管管柱分離，定性離子豐度比定性，外標法定量離子定量。標準曲線相關(guān)系數(shù)在0.998 9～0.999 8，方法檢出限為0.05 mg/kg，平均加標回收率在74.2%～91.4%，精密度相對標準偏差在0.77%～5.44%。結(jié)果表明所建立的方法經(jīng)濟、準確、可靠，適用于乳制品中四環(huán)素、金霉素、土霉素的檢測。

乳制品；LC-MS；金霉素；土霉素；四環(huán)素

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：AGi len t126 0-AB 4000Q triP；分析天平；固相萃取裝置；高速離心機；渦旋振蕩器；吹氮濃縮儀；色譜純甲醇；色譜純乙腈；乙二胺四乙酸二鈉；三氟乙酸；檸檬酸；磷酸氫二鈉。

1.2 樣品測定

稱取牛奶樣品約5 g(準確至0.0001g)于50m L具塞離心管中。

加入20 m L 0.1 mol/L NA2Ed TA-MCl l vAi n e緩沖溶液，渦旋混合1 mi n，冰水浴超聲10mi n，8000r/mi n離心10mi n[1]。

準確吸取5 m L提取液（相當于1 g樣品）以1滴/s的速度過H L B固相萃取柱，待樣液完全流出后，依次用5 m L水和5 m L甲醇+水（1+1 9）淋洗，棄去全部流出液。2.0 kPA以下減壓抽干5 mi n，最后用5 m L甲醇洗脫。將洗脫液吹氮濃縮至干（溫度40℃），用1.0 m L甲醇+10mol/L三氟乙酸水溶液（1+1 9）溶解殘渣，渦旋混合后，過0.22μm濾膜供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定[2]。

1.3 標準溶液的配制

金霉素、土霉素、四環(huán)素標準儲備液：準確稱取金霉素、土霉素、四環(huán)素標準品各1 0.00m g，分別置于100 m L容量瓶中，用甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻。金霉素、土霉素、四環(huán)素標準液濃度為100 μg/m L。

標準工作液：根據(jù)所需濃度，用甲醇+10mol/L三氟乙酸水溶液（1+1 9）稀釋至所用濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 LC-MS儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：C18（1 50m m×2.1 m m，5 μm）；柱溫：30℃；流速：400 μL/mi n；進樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件：電離方式：ES（+）；檢測方式：多反應檢測；氣簾氣：20 L/mi n；噴霧電壓：5 500 V；去溶溫度：5 50℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理過程的優(yōu)化

乳制品中含有大量蛋白質(zhì)，加入0.1 mol/L的NA2Ed TA-MCl l vAi n e緩沖溶液后，冰水浴超聲10mi n，能更好的沉淀蛋白，并通過高速離心得到澄清透明提取液，有利于凈化過程。

2.2 流動相的選擇

色譜分離一般采用甲酸、草酸或三氟乙酸水溶液,因為草酸為非揮發(fā)性酸.為使優(yōu)化的色譜分離條件也適用于液質(zhì)聯(lián)用分析[2],本研究選擇揮發(fā)性的甲酸、三氟乙酸水溶液作為流動相進行優(yōu)化，甲酸水溶液作為流動相，峰型差，色譜峰拖尾，所以選用10mol/L三氟乙酸水溶液。

2.3 標準曲線

表1 質(zhì)譜條件

為確定本方法適用的線性區(qū)間，設(shè)計試驗測定方法的線性范圍。按照方法要求，用甲醇+三氟乙酸水溶液（1+1 9）配制金霉素、土霉素、四環(huán)素含量分別為25、5 0、7 5、100、150、200n g/m L和300 n g/m L的標準曲線直接上機測定，經(jīng)驗證符合朗伯比爾定律。金霉素標準系列液濃度及回歸方程與相關(guān)系數(shù)y=3 81x+508,R2=0.999 8。土霉素標準系列液濃度及回歸方程與相關(guān)系數(shù)y=6 60x+1.01E3，R2=0.9 989。四環(huán)素標準系列液濃度及回歸方程與相關(guān)系數(shù)y=868 x+2.05E3，R2=0.999 1。

2.4 方法準確度（樣品回收率）

為驗證方法的準確度計算平均回收率和標準偏差，分別對金霉素、土霉素、四環(huán)素5 0、100、200μg/k g附近做兩個點以上的加標回收率試驗。由表2可以看出三個梯度的加標回收率結(jié)果在7 4.2%～9 1.4%。其回收率符合標準要求。

2.5 方法精密度

對金霉素、土霉素、四環(huán)素5 0、100 μg/k g加標濃度樣品分別做4個平行，計算相對標準偏差，將金霉素、土霉素、四環(huán)素5 0、100 μg/k g加標濃度重復測定4次，所得結(jié)果的相對標準偏差的結(jié)果在0.7 7%～5.4 4%，符合標準要求。

表2 純奶中不同梯度金霉素、土霉素和四環(huán)素含量加標回收率匯總

3 結(jié)語

本文建立乳制品中金霉素、土霉素、四環(huán)素的LC-MS測定方法。根據(jù)乳制品的特點采用冰水浴超聲和高速離心得到澄清提取液，采用色譜純試劑最大程度減少本底的影響[3]。通過加標回收率驗證該方法的準確性，重復性實驗驗證方法的精密度，結(jié)果表明：標準曲線相關(guān)系數(shù)為0.999 1～0.999 8，方法檢出限為0.05m g/k g，標準曲線相關(guān)系數(shù)為0.9 989～0.999 8，方法檢出限0.05m g/k g，平均加標回收率為7 4.2%～9 1.4%，精密度相對標準偏差在0.7 7%～5.4 4%。回收率、相對標準偏差和精密度都符合相關(guān)要求，可以快速、高效、準確檢測乳制品中金霉素、土霉素、四環(huán)素。

[1]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.動物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留量檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法與高效液相色譜法(GB/T21317-2007)[S].北京：中國標準出版社,2007.

[2]吉彩霓,岳振峰,謝麗琪，等.高效液相色譜法同時檢測水產(chǎn)品中7種四環(huán)素類抗生素殘留的研究[J].中國獸醫(yī)科技,2005(10):820-826.

[3]李俊鎖,邱月明,王超.獸藥殘留分析[M].上海:上海科學技術(shù)出版社,2002.