楊利珠, 張 莉, 黃 琳, 孟祥紅

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三疣梭子蟹()肝胰腺內(nèi)源酶性質(zhì)的初步研究

楊利珠, 張 莉, 黃 琳, 孟祥紅

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 山東青島266003)

內(nèi)源酶是三疣梭子蟹()體內(nèi)重要的酶, 往往會導(dǎo)致梭子蟹死后肌肉組織迅速軟化, 嚴(yán)重影響了蟹肉的貯藏品質(zhì)。為了探明該酶的基本特性, 本試驗(yàn)從三疣梭子蟹肝胰腺中提取了粗酶, 優(yōu)化了提取方法, 并對其部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明: 三疣梭子蟹肝胰腺內(nèi)源酶最佳浸提時(shí)間段為4~12 h, 酶比活顯著高于0~4 h和12~14 h; 以酪蛋白為水解底物, 內(nèi)源酶作用最適溫度為65℃、最適pH范圍為7.0~8.0; 絲氨酸蛋白酶特異性抑制劑, 包括大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI)和苯甲基磺酰氟(PMSF), 對內(nèi)源酶活力的相對抑制率分別為100%、70.46%±6.27%, 顯著高于其他抑制劑的相對抑制率, 推測絲氨酸蛋白酶為主要內(nèi)源酶; 在硫酸銨分級沉淀中, 分別以酪蛋白和Boc-Phe-Ser-Arg-MCA為底物, 前者最適鹽析濃度為0~70%, 后者為30%~70%, 酶比活顯著高于其他鹽濃度; 當(dāng)硫酸銨濃度為40%~60%時(shí), 鹽析蛋白質(zhì)含量、粗酶酶活和絲氨酸蛋白酶活均顯著高于其他鹽濃度。

三疣梭子蟹(); 肝胰腺; 內(nèi)源酶; 性質(zhì)

三疣梭子蟹()是中國經(jīng)濟(jì)價(jià)值最大的一種海水養(yǎng)殖蟹類, 約占中國梭子蟹總產(chǎn)量的90%左右[1], 由于其具有營養(yǎng)豐富和味道鮮美的特點(diǎn)而暢銷國內(nèi)外。梭子蟹因其身處海洋的特殊環(huán)境, 所以在離開高鹽高氧環(huán)境后存活率便大大降低。未經(jīng)任何處理的三疣梭子蟹, 在其死后肌肉的軟化速率較快, 并且很快發(fā)生空殼現(xiàn)象。

在水產(chǎn)品的肌肉組織和內(nèi)臟中, 存在許多內(nèi)源性蛋白酶, 它們直接或間接地加速了水產(chǎn)品在貯藏過程中肌肉軟化速率。已有國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道了遠(yuǎn)洋梭子蟹()[2]肝胰腺中的胰蛋白酶類酶、羅氏沼蝦()[3]肝胰腺中的胰蛋白酶、口蝦蛄()[4]肌肉中的絲氨酸蛋白酶和刺參()[5]消化腺中的絲氨酸蛋白酶等, 與其自身肌肉的溶解有關(guān)。但是, 對三疣梭子蟹的肌肉軟化原因還鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)擬通過對三疣梭子蟹肝胰腺內(nèi)源酶基本性質(zhì)的研究為探究三疣梭子蟹保藏過程中發(fā)生的自溶現(xiàn)象提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用鮮活三疣梭子蟹()購于青島市團(tuán)島海鮮市場, 平均質(zhì)量162 g左右, 觀察體表健康無病。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 三疣梭子蟹肝胰腺干燥脫脂粉末的制備

將鮮活的三疣梭子蟹肝胰腺取出, 稱取100 g, 按1︰3(/)加入–20℃的丙酮, 在組織搗碎機(jī)中間歇性搗碎3min, 勻漿液在真空下抽濾。將濾渣進(jìn)行真空干燥, 直至濾渣干燥且無丙酮味[6]。干燥后的肝胰腺粉末在–20℃下保藏待用。

1.2.2 三疣梭子蟹肝胰腺粗酶提取液的制備

將上述脫脂干燥粉末溶解于2倍體積的原肝胰腺濕重的0.05 mol/LTris-HCl緩沖液中(4 ℃, pH7.5), 在4 ℃條件下攪拌提取粗酶。離心15min(4 ℃, 12000 r/min), 上清液即為三疣梭子蟹肝胰腺粗酶提取液。

1.2.3 三疣梭子蟹粗酶提取時(shí)間的優(yōu)化

在0、2、4、6、8、10、12、14 h 分別取20.0 mL1.2.2中的提取液, 同條件下離心, 取上清液。向上清液中緩慢加入經(jīng)研磨干燥后的硫酸銨固體粉末, 至100%飽和度, 4℃靜置過夜。次日離心(4℃, 12000 r/min), 收集沉淀。用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(4℃, pH 7.5)復(fù)溶, 并透析24 h, 期間換液3~4次。透析后所得液體即為粗酶液。將粗酶液離心(4℃, 12000 r/min), 留上清待用。用Tris-HCl緩沖液將各透析后的粗酶液定容至等體積, 測定其蛋白質(zhì)含量及粗酶活力, 計(jì)算酶比活, 最大酶比活對應(yīng)的提取時(shí)間為最佳提取時(shí)間, 做三組平行試驗(yàn)。

1.2.4 三疣梭子蟹粗酶酶活最適溫度測定

選取上述最佳提取時(shí)間下的粗酶液, 在不同溫度(4、20、30、40、50、55、60、65、70、80℃)條件下測定其粗酶活力, 以確定最適溫度。

1.2.5 三疣梭子蟹粗酶酶活最適pH測定

于最適溫度下, 將粗酶液置于不同pH(pH2.0~11.0)條件下測定粗酶活力, 以確定最適pH。中不同pH值緩沖液分別為: 檸檬酸-Na2HPO4緩沖液(pH2.0~ 8.0)、Tris-HCl緩沖液(pH 7.0~9.0)、甘氨酸- NaOH緩沖液(pH 9.0~11.0)。

1.2.6 抑制劑對三疣梭子蟹粗酶活性的影響

參考Klomklao等[7]的方法并稍作修改。將酶液分別加入等體積不同濃度、不同抑制劑溶液中, 使抑制劑的最終濃度達(dá)到以下濃度: 0.1和5 mmol/L N-甲苯磺酰-L-賴氨酸-氯甲基酮(TLCK)、0.1和5 mmol/L甲苯磺酰-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)、0.005和1 g/mL SBTI、0.025和5 mmol/L PMSF、0.1和5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、0.025和0.1 mmol/L胃蛋白酶抑制劑A(PepstatinA)、0.025和0.1 mmol/L E-64蛋白酶抑制劑(E-64)、0.1和5 mmol/L碘乙酸。室溫下放置30 min后, 在最適pH值、最適溫度下測其粗酶活力。以超純水作為對照。計(jì)算不同蛋白酶抑制劑對粗酶活性的抑制率, 其中, 抑制率最大的設(shè)定為100%, 計(jì)算其他蛋白酶抑制劑的相對抑制率。蛋白酶活力抑制率的計(jì)算公式如下:

抑制率(%)=(C–S)/C×100

其中,C、S分別為對照組蛋白酶活力和試驗(yàn)組蛋白酶活力。

1.2.7 硫酸銨分級沉淀

向30.0 mL未經(jīng)硫酸銨沉淀的粗酶提取液中, 緩慢加入經(jīng)研磨干燥的硫酸銨固體粉末, 使硫酸銨溶液的飽和度依次達(dá)到20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、100%, 4℃條件下靜置過夜, 離心(4℃, 12000 r/min)。鹽析沉淀用適量0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(4℃, pH 7.5)復(fù)溶、透析并離心(4℃, 12000 r/min)。將各硫酸銨飽和度的粗酶液定容至蛋白質(zhì)濃度相差小于0.1 mg/mL的粗酶溶液, 分別測其粗酶活力、絲氨酸蛋白酶活力和蛋白質(zhì)含量, 并計(jì)算其相應(yīng)的酶比活, 做三組平行試驗(yàn)。

1.2.8 可溶性蛋白質(zhì)濃度測定

參考考馬斯亮藍(lán)染色法測定[8]。

1.2.9 蛋白酶粗酶活力測定

參考Jensen等[9]的方法并稍作修改。取1.0 mL粗酶液, 加入到3.0mLTris-HCl緩沖液(0.05 mol/L, pH7.5)中, 混勻, 隨后加入1 mL1%酪蛋白溶液, 37℃條件下孵育15 min, 加入1 mL10%TCA溶液終止反應(yīng)。4℃靜置2 h, 5000 r/min離心20 min, 取上清, 在280nm下測吸光值。空白管中先加入1.0 mL粗酶液與1 mL 10%TCA溶液, 混勻, 37℃條件下孵育15 min, 加入1 mL 1%酪蛋白溶液, 其余操作相同。作三組平行試驗(yàn)。該條件下, 定義每分鐘水解產(chǎn)生1μmol酪氨酸的酶量為一個(gè)蛋白酶活力單位(U)。

1.2.10 絲氨酸蛋白酶活力測定

本試驗(yàn)參考Yoshida等[10]的方法測定, 并稍作修改。取0.1 mL樣品, 加入到0.8 mLTris-HCl緩沖液(0.05 mol/L, pH7.5)中, 隨后加入0.1 mL 50 μmol/L熒光底物Boc-Phe-Ser-Arg-MCA, 混勻, 55℃條件下反應(yīng)10 min, 加入1.5 mL熒光終止液(甲醇︰異丙醇︰水=35︰35︰30)終止反應(yīng)。將混勻后的反應(yīng)液在激發(fā)波長380 nm和發(fā)射波長450 nm下測定熒光強(qiáng)度, 作三組平行試驗(yàn)。該條件下, 定義每分鐘水解產(chǎn)生1 nmolAMC的酶量為一個(gè)蛋白酶活力單位(U)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)表示, 采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA方差分析, 當(dāng)差異顯著(<0.05)時(shí), 采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取時(shí)間對三疣梭子蟹肝胰腺粗酶提取的影響

由圖1a結(jié)果可見, 提取時(shí)間對粗酶提取液中蛋白質(zhì)含量和粗酶總酶活無顯著性影響(>0.05), 但是, 從圖1b結(jié)果可見提取時(shí)間對酶比活卻有顯著性影響(<0.05)。由圖1b可看出, 在提取時(shí)間為0~2 h間, 酶比活無顯著性差異, 但在2 h后酶比活顯著升高。當(dāng)提取時(shí)間為4~12 h間, 各時(shí)間段粗酶提取液中酶比活無顯著性差異, 但在提取時(shí)間超過12 h后, 酶比活顯著下降。

注: 同一曲線上標(biāo)中含有不同字母代表組間差異顯著(< 0.05), 下同

2.2 溫度對三疣梭子蟹肝胰腺粗酶活性的影響

由圖2結(jié)果可見, 在pH為7.5的條件下, 不同溫度條件對三疣梭子蟹肝胰腺粗酶活性有顯著性影響(<0.05)。當(dāng)溫度為4~50℃時(shí), 粗酶活力隨溫度的升高而迅速增加; 當(dāng)溫度為50~65℃時(shí), 粗酶活力上升速度相對平緩, 在溫度為65℃時(shí), 粗酶活力達(dá)到最大; 但當(dāng)溫度超過65℃后, 粗酶活力迅速降低。

2.3 pH對三疣梭子蟹肝胰腺粗酶活性的影響

由圖3結(jié)果可見, 當(dāng)反應(yīng)溫度為65℃時(shí), 不同pH條件對三疣梭子蟹肝胰腺粗酶活性有顯著性影響(<0.05)。當(dāng)pH為2.0~4.0時(shí), 粗酶活力均較小, 而在pH>4時(shí), 粗酶活力隨著pH的上升而迅速增加, 且在pH為7.0時(shí)達(dá)到最大; 在Tris-HCl緩沖液體系中, 當(dāng)pH分別為7.0和8.0時(shí), 粗酶活力無顯著性差異(<0.05); 當(dāng)pH大于8.0后, 粗酶活力顯著降低。此外, 從圖中可以看出, Tris-HCl緩沖液體系(pH為7.0~9.0時(shí))中粗酶活力明顯高于檸檬酸-Na2HPO4和甘氨酸-NaOH緩沖液體系中的酶活力。因此, 后續(xù)的試驗(yàn)采用了Tris-HCl緩沖液體系。

2.4 蛋白酶抑制劑對三疣梭子蟹肝胰腺粗酶活性的影響

由表1可知, 在反應(yīng)溫度為65℃、pH為7.5的條件下, 不同抑制劑的不同濃度對三疣梭子蟹肝胰腺粗酶活力的相對抑制率有顯著性差異(<0.05)。當(dāng)SBTI濃度為1 g/L抑制率最大, 定義此抑制率為100。在各抑制劑濃度為5 mmol/L時(shí), PMSF的平均抑制率最大, 依次往下分別為EDTA、TLCK和碘乙酸; 在各抑制劑濃度為0.1 mmol/L時(shí), TLCK的平均抑制率最大, 依次往下分別為碘乙酸、PeptatinA、EDTA、E-64和TPCK; 在各抑制劑濃度為0.025 mmol/L時(shí), PMSF的平均抑制率最大, 依次往下分別為E-64、PepstainA。

表1 不同抑制劑對三疣梭子蟹肝胰腺粗酶活力的相對抑制率

注: 同列數(shù)據(jù)右上標(biāo)中不含有相同字母代表組間差異顯著(<0.05)

2.5 硫酸銨分級沉淀

由圖4可見, 不同硫酸銨濃度對三疣梭子蟹肝胰腺蛋白質(zhì)含量、粗酶總酶活、絲氨酸蛋白酶活、粗酶比活和絲氨酸蛋白酶比活均有顯著性影響(<0.05)。

由圖4a、b、c可見, 當(dāng)硫酸銨濃度在0~60%區(qū)間時(shí), 各指標(biāo)均隨著硫酸銨濃度的升高而升高, 并且在50%~60%區(qū)間時(shí)達(dá)到最大值; 當(dāng)硫酸銨飽和度大于60%后, 各指標(biāo)均顯著降低。

由圖4d中粗酶比活的趨勢可見, 當(dāng)硫酸銨濃度在0~20%時(shí), 粗酶比活相對較低, 硫酸銨濃度大于20%后有上升趨勢, 硫酸銨濃度為20%~70%間, 粗酶比活無太大差異, 但是當(dāng)硫酸銨濃度高于70%后, 粗酶比活急劇下降。由圖4d中絲氨酸蛋白酶比活的趨勢可見, 當(dāng)硫酸銨濃度在0~40%時(shí), 絲氨酸蛋白酶比活隨著硫酸銨濃度的升高而升高, 硫酸銨濃度為30%~40%和40%~50%區(qū)間時(shí)無顯著性差異, 絲氨酸蛋白酶比活在硫酸銨濃度為50%~60%時(shí)達(dá)到最大值, 當(dāng)硫酸銨濃度高于60%后, 顯著降低。

3 討論

3.1 提取時(shí)間對三疣梭子蟹肝胰腺粗酶酶活的影響

酶原分子在一定條件下發(fā)生特異肽鍵斷裂或去除部分肽段, 酶分子構(gòu)象就會發(fā)生變化, 形成具有活性的三維結(jié)構(gòu),此為酶原的激活作用。據(jù)報(bào)道[11-12],在粗酶提取緩沖液中加入鈣離子可使酶的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定[13]或?qū)γ阜磻?yīng)有激活作用。但是, 并不是對所有的胰蛋白酶都能被鈣離子激活, David等[2]報(bào)道了鈣離子反而使遠(yuǎn)洋梭子蟹()肝胰腺中類胰蛋白酶的酶活降低了4%。所以, 本試驗(yàn)沒有采用此種方法, 試驗(yàn)采用延長攪拌浸提時(shí)間的方法來增加粗酶活力。結(jié)果顯示, 適量延長浸提時(shí)間雖然對蛋白質(zhì)含量和粗酶總酶活無顯著影響, 但卻能使粗酶比活顯著增加13%, 證明用延長提取時(shí)間來增加粗酶活的方法是可行的。

脊椎動物有兩種胰蛋白酶原活化的方式, 一是酶原的自我活化, 另一種是腸激酶識別活化肽與活性酶的接點(diǎn)。吳志強(qiáng)[14]推測, 由于甲殼類動物胰蛋白酶氨基酸序列中N-末端IVGG前不存在4個(gè)連續(xù)Asp,因此其可能為自我活化機(jī)制。本試驗(yàn)中, 酶比活在浸提時(shí)間為4~12 h達(dá)到較高水平并且長時(shí)間處于穩(wěn)定狀態(tài), 隨后卻顯著降低。推測可能由于隨著攪拌時(shí)間的增長, 酶原逐漸被肝胰腺內(nèi)部某些離子激活, 隨后到達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)。然而, 當(dāng)浸提時(shí)間大于12 h, 酶比活卻顯著降低的原因還不得而知, 尚需要進(jìn)一步的研究。

3.2 溫度對三疣梭子蟹肝胰腺粗酶酶活的影響

本試驗(yàn)中, 三疣梭子蟹肝胰腺粗酶在以酪蛋白為水解底物時(shí), 酶活在反應(yīng)溫度為65℃時(shí)最大, 此結(jié)果與已報(bào)道文獻(xiàn)結(jié)果相似, 如遠(yuǎn)洋梭子蟹()類胰蛋白酶的最適溫度60℃[2]、南極磷蝦自溶酶最適溫度50~60℃[15]、兩種斑節(jié)對蝦()胰蛋白酶的反應(yīng)最適溫度為55、65℃[16], 高于海參(Holothurian)體壁粗蛋白酶的最適溫度50℃[17]、南美白對蝦()蝦頭內(nèi)源酸性蛋白酶的30℃[18]和純化的口蝦蛄()絲氨酸蛋白酶的最適溫度約37℃[4]。當(dāng)溫度到達(dá)70℃, 粗酶酶活與最大酶比活相比, 降低了11%, 推測是由于熱失活作用導(dǎo)致的。酶在高溫下失活, 可能因?yàn)槊附Y(jié)構(gòu)在高溫下會部分伸展, 破壞酶的作用位點(diǎn), 從而導(dǎo)致酶的活性降低或喪失。

3.3 pH對三疣梭子蟹肝胰腺粗酶酶活的影響

本試驗(yàn)中, 三疣梭子蟹肝胰腺粗酶在pH為7.0~ 8.0間均能保持較高活性, 此pH范圍與很多甲殼類動物的胰蛋白酶類似, 如遠(yuǎn)洋梭子蟹()[2]、太平洋磷蝦()[14]等, 也與某些動物的絲氨酸蛋白酶類似, 如羅氏沼蝦()[3]、口蝦蛄()[4]、狗母魚、鯉魚、鯽魚[19]等, 但是, 低于皇家紅蝦()[20]胰蛋白酶的9.0。同類型的酶具有不同最適pH, 主要是由于在不同的pH介質(zhì)中的不同電荷能影響底物以及酶的作用位點(diǎn), 從而影響底物與酶作用位點(diǎn)結(jié)合的緊密度[21]。一般來說, 胰蛋白酶的最適反應(yīng)pH在7.0~9.0間[22], 所以在此初步推測三疣梭子蟹肝胰腺粗酶中主要為胰蛋白酶。

3.4 抑制劑對三疣梭子蟹肝胰腺粗酶酶活的影響

本試驗(yàn)所采用的蛋白酶抑制劑中, TLCK和TPCK分別是胰蛋白酶特異性抑制劑和糜蛋白酶特異性抑制劑[7], PMSF和SBTI為絲氨酸蛋白酶特異性抑制劑[23], EDTA為金屬蛋白酶特異性抑制劑[7], PepstatinA為天冬氨酸蛋白酶特異性抑制劑[24], E-64和碘乙酸為半胱氨酸蛋白酶特異性抑制劑[24, 7]。從試驗(yàn)結(jié)果可看出, SBTI在高濃度(1g/L)時(shí)對粗酶酶活的抑制作用最大, 其次, 在抑制劑濃度為5、0.1和0.025 mmol/L時(shí), 抑制率最大的分別為PMSF、TLCK和PMSF, 均屬于絲氨酸蛋白酶類抑制劑, TPCK、PeptatinA、E-64和碘乙酸對粗酶酶活幾乎沒有抑制效果。由上述試驗(yàn)結(jié)果可推測, 在三疣梭子蟹肝胰腺的粗酶中, 主要蛋白酶為絲氨酸蛋白酶, 有可能是胰蛋白酶, 為糜蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶的可能性較小。低濃度SBTI(0.005 g/L)對粗酶酶活幾乎沒有抑制效果, 可能是由于抑制劑濃度太低, 對酶活的抑制效果非常微弱, 以至用此方法不能檢測出。

3.5 硫酸銨濃度對三疣梭子蟹肝胰腺粗酶酶活的影響

由試驗(yàn)結(jié)果可看出, 隨著硫酸銨濃度的增加, 鹽析出的蛋白質(zhì)含量、粗酶酶活呈現(xiàn)出中間高、兩端低的趨勢, 這與南美白對蝦()蝦頭自溶酶在鹽析過程中, 蛋白含量一直上升的趨勢[25]有所不同, 與草魚、鯽魚、青魚酶比活先上升后下降[26]的趨勢類似。從蛋白質(zhì)含量的趨勢可以看出, 當(dāng)硫酸銨濃度高于60%后, 鹽析出的蛋白質(zhì)含量就大幅度減少, 這說明大部分蛋白質(zhì)在低鹽濃度下就被鹽析出。但是, 從粗酶酶比活的趨勢又可看出, 在硫酸銨濃度達(dá)到70%前, 粗酶比活都保持在較高水平。該結(jié)果表明, 如果以酪蛋白作為粗酶分解底物, 對粗酶進(jìn)行后續(xù)研究, 則可選擇鹽析濃度0~70%。

通過不同抑制劑對粗酶酶活抑制效果的數(shù)據(jù), 可大致推測出, 粗酶中絲氨酸蛋白酶占主導(dǎo)地位, 所以, 本試驗(yàn)對不同鹽析濃度下的粗酶也進(jìn)行了絲氨酸蛋白酶活性的測定。結(jié)果顯示, 絲氨酸蛋白酶活和酶比活均呈現(xiàn)出中間高、兩端低的趨勢, 其酶比活在硫酸銨濃度為0~30%和70%~100%間較低。所以, 如果以粗酶中絲氨酸蛋白酶為主要研究對象, 則可選擇鹽析濃度在30%~70%之間。

4 總結(jié)

本試驗(yàn)中, 攪拌浸提時(shí)間對三疣梭子蟹肝胰腺粗酶性質(zhì)有顯著影響, 其最佳浸提時(shí)間段為4~12h; 通過對粗酶最適反應(yīng)溫度和最適pH的測定, 大致推測粗酶主要成分為類胰蛋白酶, 抑制劑對內(nèi)源酶酶活的特異性抑制試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了此推測; 粗酶在各鹽析濃度下蛋白質(zhì)含量、粗酶總酶活、絲氨酸蛋白酶活、粗酶比活和絲氨酸蛋白酶比活均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢; 如果以不同底物為蛋白酶水解對象, 可選擇不同的鹽析濃度來沉降蛋白。

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Characteristics of endogenous protease from hepatopancreas of swimming crab ()

YANG Li-zhu, ZHANG Li, HUANG Lin, MENG Xiang-hong

(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Endogenous autolytic enzyme is an important enzyme in. Normally, after the death of swimming crabs, deterioration is very rapid in the muscle, which produces a severe effect on the storage quality of crabs. To investigate few basic properties of this autolytic enzyme, crude samples were extracted from the hepatopancreas ofand the parameters are optimized. Then, a preliminary study on the enzymatic properties of the endogenous enzyme was conducted. The results showed that the optimum extraction time range of endogenous protease was 4–12 h, and the specific activity was significantly higher than that at other time points,, 0–4 h and 12–14 h. The optimal temperature and pH for hydrolysis of casein were 65℃ and 7.0–8.0, respectively. Compared with other protease inhibitors, endogenous protease activity was significantly inhibited by serine protease inhibitors, including soybean trypsin inhibitor (SBTI) and phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), suggesting that serine protease was the dominant content of this endogenous enzyme. Ammonium sulfate grading precipitation showed that fractions of 0%–70% and 30%–70% could be used to collect the targeted proteases for casein and Boc-Phe-Ser-Arg-MCA hydrolysis, respectively. Their specific activities were significantly higher than those of the samples precipitated by other ammonium sulfate fractions. Moreover, samples collected by ammonium sulfate fractions of 40%–60% had a higher protein content and total activity of crude and serine proteinase than those of the samples precipitated by other ammonium sulfate fractions.

Swimming crab (); Hepatopancreas; Endogenous protease; Characteristic

(本文編輯: 康亦兼)

Dec. 24, 2015

[Province Natural Science Foundation of Shandong, No.ZR2015CM010]

TS254.1

A

1000-3096(2016)10-0097-08

10.11759/hykx20151224003

2015-12-24;

2016-03-29

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2015CM010)

楊利珠(1990-), 女, 彝族, 四川攀枝花人, 碩士研究生, 主要從事水產(chǎn)食品化學(xué)研究, E-mail: ylz901209@163.com; 張莉, 通信作者, E-mail: qdzhangli@ouc.edu.cn