王鳳格，楊揚，易紅梅，趙久然，任潔，王璐，葛建镕，江彬，張憲晨，田紅麗，侯振華

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中國玉米審定品種標(biāo)準(zhǔn)SSR指紋庫的構(gòu)建

王鳳格1，楊揚1，易紅梅1，趙久然1，任潔1，王璐1，葛建镕1，江彬2，張憲晨2，田紅麗1，侯振華1

（1北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心/玉米DNA指紋及分子育種北京市重點實驗室，北京100097；2北京華生恒業(yè)科技有限公司，北京100083）

【目的】對數(shù)量龐大的已知玉米品種構(gòu)建可共享的作物品種標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋庫?！痉椒ā炕跓晒饷?xì)管電泳檢測平臺和植物品種DNA指紋庫管理系統(tǒng)，利用篩選的40對SSR核心引物對3 998份中國玉米審定品種標(biāo)準(zhǔn)樣品進行建庫，通過多實驗室、多檢測平臺進行建庫數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估?！窘Y(jié)果】繪制了40個玉米建庫引物的等位基因頻率分布圖作為每個引物的特征圖譜，在建庫試驗中發(fā)揮了相當(dāng)于參照樣品的作用。形成了一套十重?zé)晒饷?xì)管電泳組合，并在SSR指紋分析器中建立了一套系統(tǒng)默認(rèn)PANEL作為不同實驗室建庫時的標(biāo)準(zhǔn)PANEL。統(tǒng)計玉米審定品種指紋庫構(gòu)建的試驗情況，每份樣品具有2—5套原始試驗數(shù)據(jù)及對應(yīng)的指紋圖譜，其中61%的樣品做了2組獨立試驗，33%的樣品做了3組獨立試驗，最終建成的標(biāo)準(zhǔn)指紋庫累計缺失和差異位點僅占0.2%，數(shù)據(jù)完整性達(dá)到99.8%。在不同實驗室、不同電泳檢測平臺的評估結(jié)果表明，同一熒光電泳檢測平臺上獲得SSR指紋數(shù)據(jù)一致性高，而不同的電泳檢測平臺獲得的數(shù)據(jù)存在一定偏差，為實現(xiàn)不同實驗室的SSR指紋數(shù)據(jù)共享，需要統(tǒng)一熒光引物、分析軟件及電泳檢測平臺。對所有審定品種指紋數(shù)據(jù)進行整體兩兩比較，表明中國玉米審定品種之間差異比較大，品種間差異位點百分比集中在80%—95%（占78.28%），品種間差異位點百分比在50%以上的已達(dá)到99.21%，而低于20%的只有0.09%；對玉米審定品種雜合率水平進行分析，平均品種雜合率達(dá)到64%，主要集中在50%—80%（占89%）。通過玉米品種標(biāo)準(zhǔn)指紋比對服務(wù)平臺（網(wǎng)址：http://www.maizedna.org/）實現(xiàn)了指紋庫的共享?！窘Y(jié)論】形成了構(gòu)建作物品種SSR指紋庫的標(biāo)準(zhǔn)化程序，構(gòu)建了3 998份玉米審定品種的SSR指紋庫，通過多實驗室聯(lián)合比較試驗，保證建庫數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和數(shù)據(jù)庫的可共享性；建立了玉米品種標(biāo)準(zhǔn)指紋比對服務(wù)平臺網(wǎng)站，實現(xiàn)玉米審定品種指紋庫在全國種子檢驗系統(tǒng)的共享。

玉米；品種鑒定；DNA指紋庫；SSR

0 引言

【研究意義】主要農(nóng)作物品種審定登記制度實施以來，審定品種的數(shù)量呈逐年增多趨勢，截至2013年底，玉米審定品種數(shù)量就達(dá)到了6 291個[1]，對品種高效管理帶來了挑戰(zhàn)；隨著玉米品種資源遺傳基礎(chǔ)日趨狹窄及少數(shù)骨干親本被集中應(yīng)用，出現(xiàn)了一批在原品種基礎(chǔ)上僅做細(xì)微改良的派生品種，對品種鑒定技術(shù)提出了更高要求；品種審定后進入生產(chǎn)推廣環(huán)節(jié)，出現(xiàn)標(biāo)簽名稱與實際包裝的種子不符等品種真實性問題，增加了種子市場監(jiān)管的難度。構(gòu)建高質(zhì)量的玉米審定品種標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋庫對解決上述問題和需求具有重要意義，將為政府的品種管理、企業(yè)的品種維權(quán)、農(nóng)民的利益維護提供強有力的技術(shù)支撐[2]?！厩叭搜芯窟M展】許多作物都開展了品種DNA指紋庫構(gòu)建，其中開展較早或規(guī)模較大的主要有玉米[3-4]、水稻[5]、小麥[6]、油菜[7]、馬鈴薯[8]、番茄[9]、月季[10]、葡萄[11]等，所用建庫技術(shù)主要為SSR、SNP、INDEL、AFLP、ISSR等標(biāo)記也有少量使用。早期由于SSR引物開發(fā)難度大，引物篩選評價不夠充分，試驗程序標(biāo)準(zhǔn)化程度較低，且大部分是基于PAGE凝膠電泳檢測平臺建立起來的，不同實驗室數(shù)據(jù)可比性較差；近年來隨著引物開發(fā)數(shù)量的增多，對引物篩選和評估的強度提高，建庫程序的逐步標(biāo)準(zhǔn)化，以及熒光毛細(xì)管電泳檢測平臺的廣泛使用，所建指紋庫的質(zhì)量得到一定提高?！颈狙芯壳腥朦c】總結(jié)以往作物品種指紋庫構(gòu)建的工作，在以下幾個方面尚待進一步完善：一是未能徹底解決不同實驗室數(shù)據(jù)整合和共享的問題，不同實驗室數(shù)據(jù)采集不一致情況未能提出根本的解決方案[12-13]；二是所建指紋庫多數(shù)為選取幾十到幾百個代表性品種的規(guī)模較小的研究型數(shù)據(jù)庫，建庫樣品為自行收集的材料或種質(zhì)資源[14-15]，并非來自官方登記備案的標(biāo)準(zhǔn)樣品；三是所建數(shù)據(jù)庫停留在研究階段，未經(jīng)過大量檢驗實踐的充分驗證?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為從根本上解決玉米品種SSR指紋數(shù)據(jù)整合共享的問題，本研究通過對試驗程序、引物特征參數(shù)的設(shè)置、引物分組的設(shè)置、檢測平臺、分析軟件、數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)進一步規(guī)范，確立大規(guī)模構(gòu)建高質(zhì)量可共享指紋庫的切實可行方案；構(gòu)建規(guī)模達(dá)到近4 000份的玉米審定品種標(biāo)準(zhǔn)樣品SSR指紋庫，通過多實驗室聯(lián)合比較試驗，保證建庫數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和數(shù)據(jù)庫的可共享性，并通過建立指紋比對平臺網(wǎng)站，實現(xiàn)玉米審定品種指紋庫在全國種子檢驗系統(tǒng)的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

建庫樣品共3 998份，由國家種質(zhì)庫提供，系國家和省級農(nóng)作物品種審定委員會向品種選育單位收集或在區(qū)域試驗種子中留取的玉米審定品種標(biāo)準(zhǔn)樣品，涉及3 806份玉米審定品種，包括3 361個普通玉米品種（3 540份樣品）和445個甜糯玉米品種（460份樣品），其中168個品種有2—4個不同來源的同名樣品，這些品種基本涵蓋了中國曾經(jīng)推廣或正在推廣使用的玉米雜交種。

1.2 基因組DNA的提取

采取改良的CTAB法提取DNA：每份供試樣品均隨機抽取50粒種子形成混合樣品，充分磨碎后移入2.0 mL離心管；加入700 μL CTAB提取液，65℃水浴60 min；加入等體積的三氯甲烷/異戊醇（24﹕1）并充分混合，靜置10 min后12 000 r/min離心15 min；上清液加入等體積的預(yù)冷異丙醇沉淀DNA，12 000 r/min離心10 min，棄上清液；加入70%乙醇清洗2次，晾干后加入100 μL超純水，充分溶解后備用。除了供試樣品外，另外選用一份玉米DH系作為參照樣品進行大量DNA提取。同一批次提取的DNA樣品，隨機抽取約5%進行DNA質(zhì)量和濃度測定，根據(jù)測量值估算稀釋成工作液的倍數(shù)后對該批DNA統(tǒng)一進行稀釋。采用NanoDrop 2000 （Thermo Scientific）紫外分光光度計進行DNA質(zhì)量和濃度測定。

1.3 SSR標(biāo)記分析

40對建庫引物序列信息、采用的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序以及熒光毛細(xì)管電泳檢測程序見行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程 SSR標(biāo)記法》（NY/T 1432-2014）和已發(fā)表的論文[16-17]。每對引物其中一條的5′端用一種熒光染料進行標(biāo)記，共選用了PET、NED、VIC、FAM 4種熒光染料（Applied Biosystems，USA公司合成）。PCR反應(yīng)在Veriti 384 well Thermal cycler（Applied Biosystem）上進行，熒光毛細(xì)管電泳在ABI 3730XL DNA analyzer（Applied Biosystem）上進行，分子量內(nèi)標(biāo)采用LIZ 500。

采用儀器自帶的Date Collection Ver.1.0軟件收集原始數(shù)據(jù)并形成FSA文件。采用北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心與北京華生恒業(yè)公司合作開發(fā)的SSR指紋分析器（軟件登記號：2015SR161217）對FSA文件進行分析，分析時設(shè)置的引物特征參數(shù)見表1。

表1 建庫引物指紋分析特征參數(shù)設(shè)置表

*拖尾峰設(shè)置時先設(shè)置是否存在拖尾峰，如果是，進一步確定拖尾峰的起點，用等位基因值表示

* first set the existence of tailing peak. if it is, further determine the starting point of tailing peak with the allele value

1.4 建庫及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

建庫過程中采用了植物品種DNA指紋庫管理系統(tǒng)（以下簡稱指紋庫管理系統(tǒng)，登記號：2015SR085905），安排至少兩組獨立平行試驗，選取60%以上組數(shù)的試驗數(shù)據(jù)一致且試驗質(zhì)量較高的數(shù)據(jù)和指紋圖譜進入標(biāo)準(zhǔn)指紋庫，對多組試驗中數(shù)據(jù)不一致而指紋圖譜一致的位點，通過人工選擇一組試驗質(zhì)量較高的數(shù)據(jù)和指紋進入標(biāo)準(zhǔn)指紋庫，對數(shù)據(jù)缺失嚴(yán)重的樣品，啟動新一組獨立試驗，直到形成位點缺失率控制在5%以下的標(biāo)準(zhǔn)指紋庫。

采用Power-Marker ver.3.25進行SSR引物位點的等位基因信息統(tǒng)計，采用Microsoft Excel 2010進行引物等位基因頻率分布圖及差異位點分布圖的繪制。

1.5 建庫數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估

為評估所構(gòu)建SSR指紋庫的質(zhì)量，檢驗指紋庫共享的可能性，開展如下幾項評估試驗：（1）從建成的標(biāo)準(zhǔn)指紋庫中隨機抽取200份樣品的DNA（約占總數(shù)5%，名單略），匿名編號后提供給2個實驗室進行檢測并與標(biāo)準(zhǔn)指紋庫的數(shù)據(jù)進行對比，采用與構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)指紋庫時相同的建庫程序和電泳檢測平臺，只是儀器型號略有不同，評估不同實驗室在同一熒光電泳檢測平臺上數(shù)據(jù)采集的一致性和利用指紋庫進行成對比較的結(jié)果一致性。（2）從標(biāo)準(zhǔn)指紋庫中挑選8份代表性樣品的DNA（名單略），由北京玉米種子檢測中心實驗室統(tǒng)一進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物提供給具有貝克曼GenomeLabGeXP遺傳分析儀的三家實驗室進行檢測并與標(biāo)準(zhǔn)指紋庫的指紋進行對比，評估在不同熒光電泳檢測平臺上數(shù)據(jù)采集的一致性和利用指紋庫進行成對比較的結(jié)果一致性。

1.6 指紋比對平臺網(wǎng)站的建立

為了實現(xiàn)指紋庫在全國種子檢驗系統(tǒng)中的共享使用，建立玉米品種標(biāo)準(zhǔn)指紋比對服務(wù)平臺，平臺上可以查看玉米審定品種標(biāo)準(zhǔn)指紋庫，并提供了全庫比較、疑似比較、同名比較、范圍內(nèi)互比等便捷的比對功能。

2 結(jié)果

2.1 引物等位基因頻率分布及多態(tài)性評估

對建庫引物的總體多態(tài)性情況進行了全面的評估，從等位基因個數(shù)、基因型個數(shù)、PIC值、個體識別率、遺傳多樣性等多個參數(shù)分析，40個建庫引物總體多態(tài)性較高（表2），這套核心引物是通過代表性玉米自交系和雜交種品種篩選評估后入選的高多態(tài)性的引物，表明玉米審定品種大規(guī)模建庫對引物的評估結(jié)果與以往的篩選評估結(jié)果基本一致。

通過統(tǒng)計審定品種在40個引物位點上的等位基因頻率分布情況，繪制了40個玉米建庫引物的等位基因頻率分布圖（圖1），由于不同引物在等位基因數(shù)、等位基因頻率上具有不同的分布特征，引物的等位基因頻率分布圖可以作為每個引物的特征圖譜。

一般情況下，熒光毛細(xì)管電泳疊加峰圖與相應(yīng)引物的等位基因頻率分布圖的圖型特征應(yīng)基本相似，因此，在具體建庫試驗中，引物等位基因頻率分布圖可以發(fā)揮與參照樣品相似的作用。以引物MP35為例（圖2），該引物的等位基因頻率分布圖（A）的基本特征可以概括為175、183頻率高，175、180、188、189、193頻率中等，178、181、186、192頻率低，除此之外的其他等位基因應(yīng)沒有或極其稀有；未校正前的原始熒光毛細(xì)管電泳疊加峰圖（B1）則178、186頻率高，而175、183頻率中或低，并出現(xiàn)了2個新等位基因。這顯然與引物MP35的特征不符；對峰圖進行整體向右移動3 bp的校正后的熒光毛細(xì)管電泳疊加峰圖（B2）則完全符合引物MP35的等位基因頻率分布圖特征，表明即使沒有參照樣品，通過對照引物的等位基因頻率分布圖也可以實現(xiàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確讀取。

2.2 十重?zé)晒饷?xì)管電泳組合及PANEL的建立

基于40個玉米建庫引物的引物擴增范圍、等位基因分布等特征，形成了一套十重?zé)晒饷?xì)管電泳組合，并進一步在SSR analyzer中設(shè)置了相應(yīng)的系統(tǒng)默認(rèn)PANEL（表3），該套PANEL分4組，每組中均包括10個引物，相同顏色的熒光組合了2—3個引物。這套PANEL相當(dāng)于不同實驗室建庫時的標(biāo)準(zhǔn)語言，有助于不同實驗室建庫數(shù)據(jù)的共享，并大大提高了建庫的效率。

2.3 指紋庫構(gòu)建情況分析

統(tǒng)計審定品種指紋庫構(gòu)建的試驗情況，61%的樣品做了2組獨立試驗，33%的樣品做了3組獨立試驗，6%的樣品做了4或5組獨立試驗，每份樣品一般具有2—5套原始試驗數(shù)據(jù)及對應(yīng)的指紋圖譜。樣品指紋負(fù)責(zé)人對多組試驗數(shù)據(jù)進行審核后，缺失的位點占0.15%；不同組試驗存在數(shù)據(jù)差異的位點占6.08%。分析數(shù)據(jù)差異的原因，表明大部分是由于樣品在個別位點上一致性較差形成高低峰或多峰，介于閾值附近的峰在不同組試驗中峰高存在細(xì)微差異，造成不同組自動采集的數(shù)據(jù)不同，對這些差異位點進一步人工比較指紋圖譜，6.03%的位點指紋圖譜一致并經(jīng)人工審核后入標(biāo)準(zhǔn)指紋庫。最終建成的審定品種標(biāo)準(zhǔn)指紋庫累計缺失和差異位點僅占0.2%，數(shù)據(jù)完整性達(dá)到99.8%，標(biāo)準(zhǔn)指紋庫的數(shù)據(jù)和圖譜均來自至少2組指紋圖譜一致的獨立試驗數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性高。

表2 40個建庫SSR引物多態(tài)性評估表

A：引物等位基因頻率分布圖；B1：未校正位置的熒光毛細(xì)管電泳疊加峰圖；B2：校正位置后的熒光毛細(xì)管電泳疊加峰圖（整體向右移動3 bp）

表3 建庫SSR引物Panel組合信息表

不同實驗室在相同電泳檢測平臺上的試驗結(jié)果顯示，37個建庫引物表現(xiàn)出高度的試驗穩(wěn)定性和重復(fù)性，不同實驗室采集數(shù)據(jù)的差異低于5%，采集的指紋圖譜一致，指定樣品的成對比較結(jié)果也是一致的；3個建庫引物（M02、MP18、MP38）在不同實驗室采集數(shù)據(jù)的差異略高于5%，今后可以考慮篩選出更好的建庫引物進行替換。不同實驗室在不同電泳平臺上試驗的結(jié)果顯示：同一樣品DNA在3臺GenomeLabGeXP遺傳分析儀上獲得的原始數(shù)據(jù)的差異在0.5 bp以內(nèi)；而同一樣品DNA在GenomeLabGeXP遺傳分析儀與ABI 3730XL遺傳分析儀上獲得的原始數(shù)據(jù)存在1—5 bp的差異。評估結(jié)果表明，同一熒光電泳檢測平臺上獲得SSR指紋數(shù)據(jù)一致性高，而不同的電泳檢測平臺獲得的數(shù)據(jù)存在一定偏差，因此，要想實現(xiàn)不同實驗室的數(shù)據(jù)共享，獲得高度一致的SSR指紋圖譜和高度一致的樣品成對比較結(jié)果，需要統(tǒng)一熒光引物、統(tǒng)一分析軟件及統(tǒng)一電泳檢測平臺。

2.4 審定品種指紋庫整體情況

對審定品種指紋數(shù)據(jù)進行兩兩比較，共涉及7 332 535對比較，結(jié)果表明，中國玉米審定品種之間差異比較大，品種間差異位點百分比集中在80%—95%（占78.28%），品種間差異位點百分比在50%以上的已達(dá)到99.21%，而低于20%的只有0.09%（表4）。由于這些審定品種代表了中國生產(chǎn)上推廣的幾乎全部品種，這一信息對今后的實際品種鑒定具有一定參考價值：由于中國玉米審定品種之間差異較大，因此，實際品種鑒定中當(dāng)2個樣品之間差異位點百分比低于50%時，就需要考察2個樣品是否存在親緣關(guān)系或具有共同親本。

表4 玉米審定品種指紋數(shù)據(jù)兩兩比較情況

對玉米審定品種雜合率水平進行分析（表略），平均品種雜合率達(dá)到64%，主要集中在50%—80%（占89%），表明對大部分玉米審定品種而言，40核心引物中均能篩選到20—30個雙親互補型引物，這對利用指紋庫篩選玉米審定品種的純度鑒定引物具有重要價值。

322份樣品（約占8%）存在2—3個樣品指紋相同的情況，對這322份樣品已經(jīng)提交審定標(biāo)準(zhǔn)樣品管理機構(gòu)，正在進一步核實是否來自于同一品種，如果來自同一品種，應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)樣品庫中將指紋相同的樣品保留一份，其他進行合并或清理，如果來自不同品種，應(yīng)進一步提供其他差異。標(biāo)準(zhǔn)樣品庫的清理工作完成后，就能夠保證一個品種名稱只有一個唯一的指紋圖譜且相同的指紋圖譜只對應(yīng)一個品種名稱，從而大大提高審定品種標(biāo)準(zhǔn)指紋庫在真實性檢測實踐中的應(yīng)用價值。

2.5 指紋庫的應(yīng)用效果

玉米品種標(biāo)準(zhǔn)指紋比對服務(wù)平臺（網(wǎng)址：http://www.maizedna.org/）自2015年正式上線（網(wǎng)站界面見圖4），平臺上提供了已建成的全部玉米審定品種SSR指紋。該平臺已向農(nóng)業(yè)部授權(quán)的省級種子檢測機構(gòu)開放，甘肅、北京、河南等多個省級種子檢測機構(gòu)已經(jīng)開始使用，在市場監(jiān)督抽查、區(qū)試、品種權(quán)執(zhí)法、企業(yè)維權(quán)等真實性檢測方面已發(fā)揮了重要作用：在沒有指紋比對平臺之前，開展玉米真實性檢測時，需要將待測樣品和審定品種的標(biāo)準(zhǔn)樣品一起進行成對比較試驗，這意味著檢測機構(gòu)每次都要向種質(zhì)庫申請相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)樣品進行試驗，不僅會造成標(biāo)準(zhǔn)樣品頻繁出庫，而且使室內(nèi)檢驗的工作量翻倍；有了指紋比對平臺后，則只需對待測樣品進行試驗，然后將待測樣品指紋與平臺的標(biāo)準(zhǔn)指紋進行比對就可以直接出具檢測結(jié)果。

圖4 指紋比對服務(wù)平臺網(wǎng)站界面

3 討論

3.1 指紋庫數(shù)據(jù)的采集

指紋庫構(gòu)建時采用什么樣的數(shù)據(jù)記錄方式不僅影響數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的難易程度，還影響數(shù)據(jù)庫使用的方便程度。匯總以往指紋庫構(gòu)建時采用的數(shù)據(jù)記錄方式，主要分為以下2種：

第一種是0/1編號，即按照電泳譜帶的有無記錄，有帶記錄為1，無帶記錄為0，這種方式在早期構(gòu)建的指紋庫中被使用過[12]，現(xiàn)在的建庫中已經(jīng)較少使用。

第二種是等位基因代碼，根據(jù)等位基因代碼的編號方式進一步分為3類：第1類是按等位基因擴增產(chǎn)物大小的順序用阿拉伯?dāng)?shù)字依次編號[18]，部分研究者進一步按基因型進行了編碼[19]，這在小規(guī)模建庫時具有簡單直觀的優(yōu)點[20]，但當(dāng)建庫規(guī)模擴大時面臨新增等位基因無法編號的問題以及多實驗室數(shù)據(jù)不易整合的問題；第2類是主要依據(jù)重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)對等位基因命名，這種方式具有命名嚴(yán)謹(jǐn)規(guī)范的優(yōu)點，當(dāng)采用多種檢測平臺建庫時數(shù)據(jù)兼容性更強，在人類指紋庫構(gòu)建中采用了這種命名方式[21]，選擇的建庫引物主要是4—5堿基重復(fù)類型的，個別作物如葡萄等通過重新開發(fā)和篩選合適的引物也開始使用這種方式[11]，但這種命名方式對標(biāo)記的選擇比較嚴(yán)苛，2堿基重復(fù)類型的引物由于拖尾峰等峰型的干擾和擴增區(qū)間出現(xiàn)插入缺失的干擾不易準(zhǔn)確確定堿基重復(fù)次數(shù)，不適合采用這種命名方式。由于大部分作物在篩選建庫引物時主要考慮了引物多態(tài)性和試驗重復(fù)穩(wěn)定性，而2堿基重復(fù)類型的SSR引物的開發(fā)數(shù)量和多態(tài)性普遍高于3堿基以上的引物，造成建庫引物中2堿基重復(fù)類型的SSR引物比例較高，因此，大部分作物目前不適合采用重復(fù)次數(shù)的命名方式；第3類是依據(jù)等位基因擴增產(chǎn)物大小對等位基因命名，這種方式不僅有利于不同實驗室數(shù)據(jù)的整合，而且對標(biāo)記的要求有所降低，在大規(guī)模建庫中對擴增區(qū)間出現(xiàn)的插入缺失具有較高的容忍度，是適合目前大多數(shù)作物品種SSR指紋庫構(gòu)建的方式，本研究對玉米審定品種建庫即采用了這種數(shù)據(jù)采集方式。

3.2 指紋庫的級別

根據(jù)指紋庫的實際使用價值不同，可將指紋庫分為3個級別：初級指紋庫僅起輔助篩查的作用；中級指紋庫能夠利用指紋庫直接出具部分檢測結(jié)果，仍有部分樣品需進一步增加試驗才能出具結(jié)果；高級指紋庫能夠利用指紋庫直接出具幾乎全部檢測結(jié)果。

除了人類和少數(shù)動植物物種外，目前基于SSR標(biāo)記建立的大部分作物指紋庫仍只能起到輔助篩查的作用，而能否調(diào)取原始指紋圖譜，是影響作物SSR指紋庫利用價值的關(guān)鍵因素：與人類以個體為基礎(chǔ)的指紋庫不同，作物品種指紋庫構(gòu)建時存在品種內(nèi)部不同個體的一致性問題，如果只采集數(shù)據(jù)，則只能反映該品種的主要等位基因信息，如果同時采集指紋圖譜則不僅能反映所有等位基因及其大致比例，也能反映試驗質(zhì)量和數(shù)據(jù)的可靠程度，因此只有整合了數(shù)據(jù)和指紋圖譜的作物品種SSR指紋庫才有可能發(fā)揮直接出具檢測結(jié)果的價值。本研究構(gòu)建的玉米審定品種SSR指紋庫通過同時采集數(shù)據(jù)和指紋圖譜入庫，實現(xiàn)了能夠直接出具檢測結(jié)果的目標(biāo)，對其他作物品種SSR指紋庫構(gòu)建重要借鑒價值。

以往的研究者還在水稻[22]、高粱[15]、油菜[14]、百合[19]、大豆[23]等許多作物上開展了分子身份證的研制，通過將指紋數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為條形碼或二維碼的形式制作分子身份證，部分分子身份證還加入了商品信息等其它輔助信息[22]，但尚未見綜合利用分子數(shù)據(jù)和指紋圖譜信息的報道。下一代的分子身份證可采取與指紋庫網(wǎng)站建立鏈接的方式，建立每個品種的在網(wǎng)站上的二維碼，通過掃描二維碼，即可調(diào)取該品種的分子數(shù)據(jù)信息及指紋圖譜信息。

3.3 可共享SSR指紋庫的構(gòu)建

SSR標(biāo)記具有多等位基因的特點，這一特點對指紋庫構(gòu)建帶來正反兩方面的影響。從正面影響看，一是標(biāo)記多態(tài)性高，區(qū)分品種能力強，一個SSR標(biāo)記大約相當(dāng)于10個SNP標(biāo)記的區(qū)分能力[24]，用較少標(biāo)記就能對大量品種進行有效區(qū)分；二是基因型類型較多，可以采用混合樣品建庫，當(dāng)進行樣品成對比較時，只要在比較的位點上不存在共同等位基因，即使樣品一致性差，也可以明確判定為差異位點，而SNP標(biāo)記基因型最多只有3個，在樣品一致性差的情況下無法采用混合樣品建庫及成對比較；三是雜交種的雜合率比較高，可以很容易篩選到雙親互補型的引物用于雜交種純度鑒定。從負(fù)面影響看，一是SSR標(biāo)記等位基因數(shù)一般在2個以上，不屬于二態(tài)的標(biāo)記類型，基因分型主要采用基于長度多態(tài)的電泳檢測平臺，檢測通量一般在10個位點以內(nèi)，很難實現(xiàn)位點高通量的檢測；二是等位基因分布比較密集帶來不同實驗室、不同檢測平臺數(shù)據(jù)整合的難度。對于SSR檢測通量低問題，今后通過擴增產(chǎn)物測序的方式有可能實現(xiàn)一次檢測幾千個SSR位點。實現(xiàn)幾百到幾千個位點的復(fù)合檢測[25]。對于指紋庫數(shù)據(jù)整合的問題，目前采取在建庫方案、取樣方案、檢測平臺、指紋分析工具和引物設(shè)置等方面進行統(tǒng)一規(guī)范的方式實現(xiàn)SSR數(shù)據(jù)整合[26]，今后可通過開發(fā)重復(fù)次數(shù)嚴(yán)格按照重復(fù)單元的倍數(shù)增減的3—5堿基重復(fù)類型的玉米SSR引物，并在指紋數(shù)據(jù)采集時依據(jù)重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)對等位基因命名，從而大大降低共享數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的難度。

在建庫程序標(biāo)準(zhǔn)化的基礎(chǔ)上，為進一步消除不同實驗室或同一實驗室不同時期試驗的系統(tǒng)誤差，還需要通過參照樣品進行數(shù)據(jù)的校正。熒光毛細(xì)管電泳檢測平臺上只需提供1份參照樣品就可發(fā)揮校正系統(tǒng)誤差的作用，在玉米指紋庫構(gòu)建過程中，為試驗設(shè)計方便，將每塊電泳板的最后一個孔位作為放置參照樣品擴增產(chǎn)物的位置，SSR指紋分析器在指紋分析過程中，依據(jù)該位置的已知標(biāo)準(zhǔn)指紋對PANEL進行左右整體位移，直到參照樣品的讀取指紋與其已知標(biāo)準(zhǔn)指紋一致。參照樣品在作物品種共享指紋庫構(gòu)建中的價值已經(jīng)得到了認(rèn)可，然而選用什么樣的參照樣品，以及如何使用參照樣品還有待商榷：部分研究者推薦的參照樣品是從國家?guī)熘羞x取的一套代表建庫引物的主要等位基因的標(biāo)準(zhǔn)樣品[27]。從今后的檢測實踐看，參照樣品應(yīng)同時具有樣品高度一致和容易大量提供的特點，由指定實驗室統(tǒng)一繁殖并統(tǒng)一提供比從國家?guī)烊∮酶臃奖?，一致性高的自交系（或DH系）比雜交種更適合作參照樣品。

4 結(jié)論

通過對試驗程序、引物特征參數(shù)的設(shè)置、引物分組的設(shè)置、檢測平臺、分析軟件、數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)進一步規(guī)范，形成了構(gòu)建作物品種SSR指紋庫的標(biāo)準(zhǔn)化程序。構(gòu)建了近4 000份高質(zhì)量玉米審定品種的SSR指紋庫，建立了玉米品種標(biāo)準(zhǔn)指紋比對服務(wù)平臺網(wǎng)站，實現(xiàn)了玉米審定品種指紋庫在全國種子檢驗系統(tǒng)中的共享。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Construction of an SSR-Based Standard Fingerprint Database for Corn Variety Authorized in China

WANG Fengge1, YANG Yang1, YI Hongmei1, ZHAO Jiuran1, REN Jie1, WANG Lu1, GE Jianrong1, JIANG Bin2, ZHANG Xianchen2, TIAN Hongli1, HOU Zhenhua1

(1Maize Research Center, Beijing Academy of Agriculture & Forestry Sciences/Beijing Key Laboratory of Maize DNA Fingerprinting and Molecular Breeding, Beijing 100097;2Beijing TodaySoft Inc., Beijing 100083)

【Objective】 It is of great importance to construct a shareable high-quality crop variety standard DNA fingerprint database for effectively managing the huge number of known varieties.【Method】 Based on fluorescence capillary electrophoresis detection platforms and the plant variety DNA fingerprint database management system, a database containing 3 998 maize authorized accessions was built with 40 SSR primer pairs. Multi-laboratories and multi-detecting platforms were used to conduct the quality evaluation of the database.【Result】 Allele frequency distribution graphs of the 40 corn primers were plotted as characteristic spectrums of each primer, which played the role of the similarity of reference samples in the database construction. A decuplet fluorescent capillary electrophoresis combination was formed and a set of system default PANEL was established in the SSR analyzer. Statistics were conducted on the experimental conditions of the database construction. Of the total samples, 61% of them were subjected to two group independent trials and 33% of them were subjected to three group independent trials. Each sample had 2-5 sets of original experimental data and the corresponding fingerprint maps. The accumulated loss and variable sites of the final built standard fingerprint database accounted for only 0.2%, the data integrity reached 99.8%. The assessment results in different laboratories and different electrophoresis platforms showed that the SSR fingerprint data obtained high agreement on the same electrophoresis fluorescence detection platform, but showed a certain bias in different electrophoretic detection platforms. In order to realize the sharing of SSR fingerprint data in different laboratories, a unified fluorescent primer, analysis software and electrophoresis detection platform were needed. Overall pairwise comparisons were conducted on all the fingerprint data, the results showed that there existed a relative big overall difference among the certification varieties of corn in China. Percentage of different sites among the authorized varieties was mainly concentrated between 80% and 95% (accounted for 78.28%), the percentage of different sites with more than 50% reached 99.21%, and less than 20% of only 0.09%. The average hybrid rate of the authorized varieties reached 64% and mainly concentrated between 50% and 80% (accounted for 89%). By using the corn variety standard fingerprint matching service platform (URL: http: //www.maizedna.org/), a shared fingerprint database is realized. 【Conclusion】 A standard procedure in constructing crop variety SSR fingerprint database was formed in this study and the SSR fingerprint database was constructed with a scale of nearly 4 000 corn authorized varieties. Through joint multi-laboratory comparison tests, the accuracy of database building and the sharing property of database were ensured. A service platform website for corn variety standard fingerprint matching was established in this study, thus achieving sharing of corn authorized variety fingerprint database in national seed identification system, and providing an important reference for other crop species in building high-quality SSR fingerprint database.

maize; variety identification; DNA fingerprint database; SSR

2016-07-11；接受日期：2016-09-27

國家“十三五”科技支撐計劃（2015BAD02B02）、北京市農(nóng)林科學(xué)院院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項（KJCX20161501）

王鳳格，E-mail：gege0106@163.com。楊揚，E-mail：caurwx@163.com。易紅梅，E-mail：yihm47@sina.com。王鳳格、楊揚和易紅梅為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者趙久然，E-mail：maizezhao@126.com