王玉娣，章建國，劉益飛

(1.高郵市婦幼保健院，江蘇 揚(yáng)州 225600；2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南通 226001)

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shSASH1基因?qū)β殉舶┘?xì)胞SKOV3生物學(xué)功能的影響

王玉娣1，章建國2，劉益飛2

(1.高郵市婦幼保健院，江蘇 揚(yáng)州 225600；2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南通 226001)

目的 探討SASH1對卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖、凋亡與侵襲方面的影響。方法 標(biāo)本組織來源于婦產(chǎn)科手術(shù)收集的50例卵巢癌組織。通過建立重組質(zhì)粒pcDNA3.1-SASH1，并借助于脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染到SKOV3，采用流式細(xì)胞計(jì)(FCM)分析實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，來探索SASH1對卵巢癌細(xì)胞SKOV3在細(xì)胞擴(kuò)散、凋亡和侵襲中的影響。結(jié)果 pcDNA3.1-SASH1轉(zhuǎn)染組中的S期細(xì)胞分值(%)低于正常(未轉(zhuǎn)染的)對照組(χ2=26.78，P<0.01)或空載組(pcDNA3.1)(χ2=25.12，P<0.01)。與空載組和正常(未轉(zhuǎn)染的)對照組相比，pcDNA3.1-SASH1轉(zhuǎn)染組中的SKOV3明顯降低了癌細(xì)胞的生長、增殖和侵襲的能力(χ2=31.25，P<0.01)，然而在空載組和正常(未轉(zhuǎn)染的)對照組中沒有明顯的差異；pcDNA3.1-SASH1細(xì)胞組顯示更多的凋亡細(xì)胞(χ2=36.58，P<0.01)。結(jié)論 SASH1可抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3的生長、增殖和侵襲能力，并促進(jìn)其凋亡。

SASH1基因；卵巢癌細(xì)胞SKOV3；增殖；凋亡；侵襲

卵巢癌是最致命的婦科惡性腫瘤之一，是婦科腫瘤死亡的主要原因[1-2]。卵巢癌通過多基因發(fā)展變化，目前還未明確這些信號道路是如何發(fā)揮作用的。新的致癌基因和抑癌基因的發(fā)現(xiàn)仍是了解此病發(fā)病機(jī)制的重要途徑[3-4]。SASH1(SAM- and SH3-domain containing 1, SASH1)基因，是一種新的候選抑癌基因，是SLY(SH3-domain containing expressed in lymphocytes, SLY)基因家族中的一種信號銜接蛋白[5]，在人體多種正常組織中廣泛表達(dá)。隨著對SASH1基因的研究，發(fā)現(xiàn)SASH1基因在多種腫瘤組織中表達(dá)下降，如結(jié)腸癌、黑色素瘤、肺癌、骨肉瘤、食管鱗癌等；并對腫瘤的侵襲性生長、轉(zhuǎn)移灶的形成及預(yù)后產(chǎn)生影響[6]。但至今國內(nèi)外仍未見SASH1基因與卵巢癌細(xì)胞之間關(guān)系的研究報(bào)道。本研究主要探討SASH1基因?qū)β殉舶┘?xì)胞SKOV3生物學(xué)功能方面的影響，在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，是否能成為卵巢癌獨(dú)立預(yù)后的指標(biāo)之一。

1資料與方法

1.1研究對象

新鮮卵巢癌組織切除樣本來自2011年1月至2013年12月南通大學(xué)附屬醫(yī)院50名卵巢癌患者。樣本取出后立即放入液氮中，然后置于-80℃冰箱中保存，按照倫理和法律標(biāo)準(zhǔn)，所有患者匿名。所有卵巢癌患者術(shù)前均未做任何治療，均無其他相關(guān)炎癥性疾病。手術(shù)切除的50例卵巢癌組織均被病理診斷核實(shí)，并且有完整的臨床資料。

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒構(gòu)建

基因SASH1開放側(cè)面引物和限制性內(nèi)切酶的設(shè)計(jì)采用Primer Premier 5軟件實(shí)施。正向引物：5′-CG GGATCC ATG GAG GAC GCG GGA GCA GC-3′，包含BamHⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；反向引物：5′-CC CTCGAG CAT GGC CTC AGG GCC TGG CG-3′，包含XhoⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。cDNA第1條鏈由來自SKOV3細(xì)胞的mRNA的模板合成，PCR用基因SASH1的引物來引導(dǎo)。PCR產(chǎn)品被克隆成pGEM-T空載。經(jīng)過限制性核酸內(nèi)切酶裂解和識別后，校正的重組質(zhì)粒被序列化?？蛰dpcDNA3.1和重組質(zhì)粒pGEM-SASH1 同時(shí)被限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和Xho I裂解，目標(biāo)片段被分別收集，并通過T4 DNA連接酶連接，重組質(zhì)粒pGEM-SASH1被轉(zhuǎn)換為DH5α感應(yīng)細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將卵巢癌SKOV3細(xì)胞置于RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37°C、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)24h后，收集在對數(shù)生長期的細(xì)胞，以便實(shí)驗(yàn)。建立正常(未轉(zhuǎn)染的)對照組。在常溫下，SKOV3細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)皿中，采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染為空帶菌者(pcDNA3.1)和重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-SASH1。質(zhì)粒被無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻；將脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000添加到RPMI-1640培養(yǎng)基中，輕度混合后，在常溫下培養(yǎng)5min后，與稀釋的質(zhì)?；旌?；在常溫下培養(yǎng)20min，形成混合物，加到含有SKOV3細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，置于37℃、飽和濕度、5%CO2中培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h后，再換到含有5%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h。在SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1-SASH1 48h后，采用Western blot分析測定SASH1表達(dá)。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期

在常溫下，培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞均勻接種在6孔培養(yǎng)皿中，濃度為3×105細(xì)胞/mL。轉(zhuǎn)染后48h，收集的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化后，在PBS中洗2次，加入預(yù)冷的70%乙醇，在-20℃下固定24h。次日，用檸檬酸-磷酸鹽緩沖液和PBS 洗后，再按0.1mg/mL加入RNase溶液，在37℃下靜置30min，之后加入PI溶液染色30min。細(xì)胞被保存在避光的冰上，并立即對之進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析。采用Macquit 和 FCM Cell Quest軟件來分析。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4生長曲線分析

在細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染了24h、48h、72h和96h后，用Hoechst33342 (Beyotime公司)對SKOV3細(xì)胞株進(jìn)行染色。用DME熒光顯微鏡觀察染色后的細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量，并借助Image Pro Plus 6.0版軟件來統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總數(shù)。從3個(gè)孔板中隨機(jī)選取10個(gè)視野統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量。此試驗(yàn)被重復(fù)3次。

1.2.5 FCM測定細(xì)胞凋亡

在常溫下，收集培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞，均勻接種在6孔培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染后48h，細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，在PBS中洗兩次，懸浮放入195μL Annexin V-FITC(Roche公司) 結(jié)合緩沖液中。加入5μL的Annexin V-FITC并輕輕地混合，SKOV3 細(xì)胞在室溫下避光染色10min，然后，將SKOV3細(xì)胞以1 000g離心5min，并輕柔地懸浮在190μL Annexin V-FITC結(jié)合緩沖液中。最后，加入10μL PI著色液，輕輕地混合，細(xì)胞被保存在避光的冰上，并立即采用Macquit 和 FCM Cell Quest軟件來分析。此試驗(yàn)被重復(fù)3次。

1.2.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

將20μL基質(zhì)膠均勻地覆蓋在聚碳酸脂膜(8.0μm)的表面，從而形成基質(zhì)膠膜。轉(zhuǎn)染后，每一組SKOV3細(xì)胞覆蓋在無血清培養(yǎng)基的transwell小室的聚碳酸酯膜的上邊。在室溫下5%CO2培養(yǎng)48h后，觀察細(xì)胞的情況，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞1～2次，并用Hoechst 33342染色。穿過濾過膜的癌細(xì)胞即侵襲細(xì)胞，這些細(xì)胞被隨機(jī)分為8個(gè)視野，放在Leica顯微鏡下觀察并計(jì)算數(shù)量，每一組重復(fù)試驗(yàn)3次，結(jié)果取平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析采用Stata 7.0軟件，χ2檢驗(yàn)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 SASH1對卵巢癌細(xì)胞SKOV3 細(xì)胞增殖的影響

用FCM來檢測SASH1在SKOV3細(xì)胞周期中的情況。結(jié)果顯示，pcDNA3.1-SASH1轉(zhuǎn)染組中的S期細(xì)胞分值(%)低于正常(未轉(zhuǎn)染的)對照組(χ2=26.78，P<0.01)或空載組(pcDNA3.1)(χ2=25.12，P<0.01)。其S期分?jǐn)?shù)在正常(未轉(zhuǎn)染的)對照組和空載組沒有明顯的區(qū)別，見圖1。通過細(xì)胞生長曲線觀察轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-SASH1的SKOV3的生長情況，與空載組或?qū)φ战M相比，轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-SASH1的SKOV3細(xì)胞株的數(shù)量在轉(zhuǎn)染后的48h、72h、96h都是降低的。見圖2。提示SASH1可能會抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖。

注：曲線顯示pcDNA3.1-SASH1轉(zhuǎn)染組、空載組和正常(未轉(zhuǎn)染的)對照組不同時(shí)間長度的SKOV3的生長變化，在Hoechst 33342著色后通過顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)評估。pcDNA3.1-SASH1轉(zhuǎn)染組的SKOV3細(xì)胞數(shù)明顯減少(**P<0.05)

圖1 FCM分析SASH1對卵巢癌細(xì)胞SKOV3擴(kuò)散的影響，并與空載組和正常(未轉(zhuǎn)染的)對照組比較

Fig.1 Effect of SASH1 on proliferation of ovarian cancer cell SKOV3 analyzed by FCM and comparison with empty vector group and normal(non-transfected) control group

圖2 細(xì)胞生長曲線分析SASH1 對卵巢癌細(xì)胞SKOV3生長的影響

Fig.2 Effect of SASH1 on the growth of ovarian cancer cell SKOV3 analyzed by cell growth curve

2.2 SASH1對卵巢癌細(xì)胞SKOV3凋亡的影響

經(jīng)Annexin V和PI雙染后，用FCM來分析SASH1在SKOV3中的凋亡情況。FCM結(jié)果顯示，pcDNA3.1-SASH1轉(zhuǎn)染組的凋亡百分比明顯高于正常(未轉(zhuǎn)染的)對照組和空載組(χ2=36.58，P<0.01)。然而，細(xì)胞凋亡數(shù)在正常(未轉(zhuǎn)染的)對照組和空載組之間沒有明顯的區(qū)別，提示SASH1可能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞SKOV3凋亡，見圖3。

注：與空載組和正常(未轉(zhuǎn)染的)對照組相比，pcDNA3.1-SASH1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞SKOV3凋亡明顯增多(**P<0.01)。

圖3 FCM分析SASH1在卵巢癌細(xì)胞SKOV3凋亡中的影響

Fig.3 Effect of SASH1 on the apoptosis of ovarian cancer cell SKOV3 analyzed by FCM

2.3 SASH1對卵巢癌細(xì)胞SKOV3侵襲的影響

通過transwell試驗(yàn)來評估SKOV3的侵襲能力。與正常(未轉(zhuǎn)染的)對照組和空載組相比，pcDNA3.1-SASH1轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞株穿過濾過膜的數(shù)量明顯降低(χ2=31.25，P<0.01)。提示SASH1的過度表達(dá)與SKOV3的侵襲能力有關(guān)，見圖4。

注：穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞量在Hoechst 33342著色后通過顯微鏡下計(jì)數(shù)及評估，結(jié)果顯示，與空載pcDNA3.1和正常(未轉(zhuǎn)染的)對照組相比，pcDNA3.1-SASH1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞數(shù)明顯減少(**P<0.01)。

圖4 transwell實(shí)驗(yàn)分析SASH1對卵巢癌細(xì)胞SKOV3侵襲的影響

Fig.4 Effect of SASH1 on invasion of ovarian cancer cell SKOV3 analyzed by transwell experiment

3討論

SASH1基因通過多種途徑對細(xì)胞增殖、分化、凋亡及免疫應(yīng)答實(shí)行調(diào)控，并參與腫瘤侵襲性生長、轉(zhuǎn)移灶的形成，從而參與了多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。SASH1由22個(gè)外顯子和21個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成， 其表達(dá)產(chǎn)物包含兩個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域：SH3和SAM域[7]。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域都能調(diào)節(jié)介導(dǎo)蛋白對蛋白的相互作用，SH3域通過識別富含脯氨酸和疏水殘基的序列來介導(dǎo)蛋白之間的相互作用，而SAM域以一種更復(fù)雜的方式發(fā)揮作用-它們通過其他蛋白上SAM域中的同源和異源性寡聚化反應(yīng)來介導(dǎo)蛋白之間的相互作用，也通過介導(dǎo)Smaug蛋白質(zhì)和mRNAs捆綁來調(diào)整轉(zhuǎn)錄[8]。蛋白基因結(jié)構(gòu)的分析揭示，SASH1是一個(gè)最近被描述為SH3/SAM適配分子家族的一員，并因此提示其參與相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[9]。在過去幾年里，SASH1一直被證實(shí)作為一個(gè)候選的腫瘤抑制基因，它廣泛表達(dá)于人體的乳腺、肺、甲狀腺、胸腺等正常組織和上皮細(xì)胞系中(淋巴細(xì)胞除外)，SASH1的減少或缺失與腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移及不良的預(yù)后密切相關(guān)。Zeller等[7]于2003年首先報(bào)道65例乳腺癌中，有70%的乳腺癌樣本中，出現(xiàn)SASH1mRNA的表達(dá)水平明顯降低；另30%乳腺癌樣本出現(xiàn)SASH1基因缺失。而且，在甲狀腺原發(fā)性癌中的表達(dá)也明顯降低。此外，SASH1表達(dá)的下調(diào)與不同時(shí)期的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。SASH1表達(dá)的下調(diào)可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和演化過程中發(fā)揮重要作用。本研究的目的是通過研究SASH1對卵巢癌細(xì)胞株SKOV3影響，從而探討其在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

為了分析SASH1對卵巢癌細(xì)胞SKOV3在細(xì)胞生物學(xué)特征方面的影響，本研究構(gòu)建了SASH1的重組表達(dá)空載體和pcDNA3.1-SASH1轉(zhuǎn)染組。SASH1在轉(zhuǎn)染上pcDNA3.1-SASH1的SKOV3中呈過度表達(dá)，但在空載組和正常(未轉(zhuǎn)染的)對照組，其表達(dá)水平較低。因此，成功建立了SASH1的過度表達(dá)細(xì)胞模型。通過使用細(xì)胞生長曲線或FCM分析SASH1對 SKOV3生長和增殖中的影響。FCM分析顯示，pcDNA3.1-SASH1轉(zhuǎn)染組中的S期分?jǐn)?shù)(%)低于正常(未轉(zhuǎn)染的)對照組(P<0.01)或空載組(P<0.01)。與正常(未轉(zhuǎn)染的)對照組或空載組相比，SKOV3細(xì)胞數(shù)被轉(zhuǎn)染上pcDNA3.1-SASH1后48h、72h及96h均表現(xiàn)為減少。這些研究的結(jié)果提示，SASH1可能抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3的生長和增殖。然而，準(zhǔn)確的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。運(yùn)用FCM檢測SASH1 對 SKOV3細(xì)胞凋亡的作用的過程中采用了Annexin V和PI雙染，結(jié)果，pcDNA3.1-SASH1轉(zhuǎn)染組中的凋亡細(xì)胞的百分比明顯高于正常(未轉(zhuǎn)染的)對照組和空載組(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，SASH1作為腫瘤抑制基因，除了可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，還可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

在本研究中，通過Transwell試驗(yàn)即細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)來研究SASH1對SKOV3的侵襲能力的影響。與正常(未轉(zhuǎn)染的)對照組和空載組相比，穿過聚碳酸酯膜pcDNA3.1-SASH1轉(zhuǎn)染組中的細(xì)胞量明顯減少(P<0.01)。這些數(shù)據(jù)提示SASH1的過表達(dá)與SKOV3侵襲能力被抑制有關(guān)。原因是SASH1調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架，并促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)的黏附作用，而黏附功能的下降是惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[6]。Martini等[10]也證明了SASH1可以通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架之間的相互作用，促進(jìn)細(xì)胞機(jī)制黏附，抑制癌細(xì)胞的增殖；SASH1的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞黏附于纖維連接蛋白和層黏連蛋白增多，因而抑制了癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。提示SASH1可能涉及卵巢癌的浸潤和轉(zhuǎn)移，SASH1在抑制轉(zhuǎn)移過程中可能也起重要的作用。研究結(jié)果表明，SASH1參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子途徑。

綜上所述，SASH1抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3的生長、增殖和侵襲能力，并促進(jìn)其凋亡，提示SASH1可能在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。SASH1蛋白在卵巢癌中如何導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制還有待今后進(jìn)一步的研究，從而為卵巢癌的治療提供更新的方法。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：張冠軍]

Effect of shSASH1 gene on biological function of ovarian cancer cell SKOV3

WANG Yu-di1, ZHANG Jian-guo2, LIU Yi-fei2

(1.Maternal and Child Health Care Hospital of Gaoyou, Jiangsu Yangzhou 225600; China;2.AffiliatedHospitalofNantongUniversity,JiangsuNantong226001,China)

Objective To investigate the effect of SAM- and SH3-domain containing 1 (SASH1) on cell proliferation, apoptosis and invasion of ovarian cancer cell SKOV3. Methods Sample tissues were collected from tissues of 50 cases of human ovarian cancer in gynecologic surgery. A recombinant plasmid pcDNA3.1-SASH1 was established and transfected into SKOV3 cells with help of Lipofectamine 2000. Effect of SASH1 on cell proliferation, apoptosis and invasion of ovarian cancer cell SKOV3 were explored through flow cytometry (FCM) analysis and cell invasion test. Results Cell proportion (%) at S stage in pcDNA3.1-SASH1 transfected group was lower than normal (non-transfected) control group (χ2=26.78,P<0.01) or empty vector group (pcDNA3.1) (χ2=25.12,P<0.01). Ability of growth, proliferation and invasion of cancer cells SKOV3 reduced significantly in pcDNA3.1-SASH1 transfected group compared to empty vector group and normal (non-transfected) control group (χ2=31.25，P<0.01), but there was no significant difference between the empty vector group and normal (non-transfected) control group. Significantly more apoptotic cells were found in pcDNA3.1- SASH1 group than in empty vector group and normal control group (χ2=36.58,P<0.01). Conclusion SASH1 can inhibit growth, proliferation and invasion of ovarian cancer cell SKOV3, and promote its apoptosis.

SASH1; ovarian cancer cell SKOV3; proliferation; apoptosis; invasion

2016-05-27

王玉娣(1973-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事卵巢腫瘤臨床診療工作。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.12.015

R737.31

A

1673-5293(2016)12-1475-04