尹玉偉 ， 張培軍 ， 夏克立 ， 康學(xué)會(huì) ， 劉新宇 ， 李月紅

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 吉林長(zhǎng)春130118； 2.吉林省衛(wèi)生監(jiān)測(cè)檢測(cè)中心， 吉林長(zhǎng)春130118；3.吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院， 吉林長(zhǎng)春130000； 4.吉林省長(zhǎng)春市新立城水庫(kù)管理局， 吉林長(zhǎng)春130119)

水生動(dòng)物嗜水氣單胞菌新型疫苗研究進(jìn)展

尹玉偉1， 張培軍2， 夏克立3， 康學(xué)會(huì)3， 劉新宇4， 李月紅1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 吉林長(zhǎng)春130118； 2.吉林省衛(wèi)生監(jiān)測(cè)檢測(cè)中心， 吉林長(zhǎng)春130118；3.吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院， 吉林長(zhǎng)春130000； 4.吉林省長(zhǎng)春市新立城水庫(kù)管理局， 吉林長(zhǎng)春130119)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila，Ah)屬于弧菌科、氣單胞菌屬，自然界中廣泛分布，可引起魚類、兩棲類及爬行類動(dòng)物暴發(fā)出血性敗血癥，并且對(duì)人類也有致病性，是一種典型的人-獸-魚共患的致病菌。Ah是魚類發(fā)病的主要病原，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，過去對(duì)Ah的防治主要以抗生素為主，隨著國(guó)內(nèi)外的學(xué)者對(duì)Ah的研究逐漸深入，防治Ah的疫苗也有了很大的進(jìn)展。本文將從嗜水氣單胞菌的核酸疫苗、重組亞單位疫苗以及菌蛻疫苗的研究進(jìn)行綜述。

1 核酸疫苗

核酸疫苗近些年發(fā)展起來的新技術(shù)，是用編碼免疫原或者與免疫原相關(guān)的真核生物表達(dá)質(zhì)粒DNA(或RNA)，它經(jīng)過一定的途徑進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，被動(dòng)物宿主細(xì)胞攝取后能轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)出抗原蛋白，此抗原蛋白能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而起到免疫保護(hù)的作用[1]。

雖然魚類核酸疫苗研究起步較晚，但是近些年也取得的很多成果。自1991年，Hansen等通過給鯉魚注射重組的DNA后，能在肌肉中檢測(cè)出相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物[2]。2013年，中國(guó)學(xué)者李盼等通過現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)Ah外膜蛋白momp進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體，獲得重組質(zhì)粒，構(gòu)建DNA疫苗；將表達(dá)蛋白免疫SD大鼠，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，用ELISA對(duì)大鼠血清進(jìn)行檢測(cè)，RT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，都證明momp的表達(dá)，為下一步動(dòng)物試驗(yàn)打下了基礎(chǔ)[3]。與此同時(shí)，在2013年，美國(guó)學(xué)者Pridgeon通過重組一種載脂蛋白(ApoA1)，將ApoA1基因的DNA重組到質(zhì)粒中，通過注射斑點(diǎn)叉尾鮰后，發(fā)現(xiàn)ApoA1能在魚體組織中表達(dá)，在對(duì)嗜水氣單胞菌具有較好的免疫保護(hù)作用，提出ApoA1能作為嗜水氣單胞菌的DNA疫苗[4]。

2 重組亞單位疫苗

亞單位疫苗是通過提取病原微生物的某些成分制成的疫苗，如病毒的衣殼蛋白、包膜蛋白，細(xì)菌的外膜蛋白、脂多糖(LPS)、類毒素、外毒素等。

近些年Ah重組亞單位疫苗取得了不小的進(jìn)展，2010年，張翠娟等在對(duì)Ah的溶血素基因(hly基因)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，轉(zhuǎn)入原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)獲得產(chǎn)物能與抗體相互結(jié)合，將表達(dá)的產(chǎn)物做成類毒素免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)具較高的保護(hù)效率[5]。之后，在2012年，Wu等通過克隆、純化嗜水氣單胞菌的膜外蛋白epr2～3，免疫ICR小鼠后得到較高的抗體滴度，在免疫沒有接觸過嗜水氣單胞菌的鳊魚后得到較好的免疫保護(hù)，并且與普通滅活苗對(duì)比免疫效果得到了顯著的提升[6]。Maiti等通過克隆Ah的兩個(gè)表面蛋白Aha1和OmpW，分別注射免疫鯉魚后，在用Ah感染后，存活率分別提高到52%和71%[7]。Wang等通過重組提取Ah的表面膜蛋白Omp38，分離純化后的蛋白、死疫苗和PBS同時(shí)進(jìn)行免疫鯉魚，發(fā)現(xiàn)IgM滴度和注射死疫苗的組沒有顯著差異，并且都顯著高于PBS組；除此之外，SOD、溶酶體活性和頭腎細(xì)胞的吞噬作用顯著高于其他組；在應(yīng)對(duì)Ah感染時(shí)，Omp38蛋白表現(xiàn)出較好的效果[8]。在2015年，Liu等用低聚糖核苷酸為引物，將Ah的基因組導(dǎo)入質(zhì)粒，在大腸桿菌中表達(dá)后，通過提純蛋白并用碳納米管作為載體，浸浴免疫草魚后，發(fā)現(xiàn)腸道微生物發(fā)生了相應(yīng)的改變，七種免疫相關(guān)基因(IFN-I、TNF-α、CRP、IL-8、IgM、MHC I 和CD8α)在腸道，腎和脾表達(dá)顯著提高，免疫后的草魚能較好的抵抗Ah[9]。最近，2016年，Abdelhamed等在對(duì)Ah的基因進(jìn)行序列分析后，篩選出四個(gè)菌毛蛋白(FimA、Fim、MrfG和FimOM)，進(jìn)行蛋白質(zhì)分離純化，分別通過注射免疫斑點(diǎn)叉尾鮰后，在對(duì)注射Ah強(qiáng)毒，與對(duì)照組相比存活率分別提升59.83%、95.41%、85.72%和75.01%；此外，免疫的魚肝臟、脾臟和頭腎細(xì)菌量顯著低于未免疫的魚，因此，F(xiàn)im和FimMrfG蛋白適合作為Ah的候選蛋白疫苗[10]。2016年，F(xiàn)u等通過將傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)的orf086蛋白基因插入到嗜水氣單胞菌的ompA的基因中，獲得重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染到大腸桿菌中，再將大腸桿菌和嗜水氣單胞菌進(jìn)行融合，用LB培養(yǎng)基進(jìn)行篩選后，獲得重組的嗜水氣單胞菌，用甲醛將重組的嗜水氣單胞菌滅活后通過注射免疫鱸魚，發(fā)現(xiàn)這種菌能較好的保護(hù)ISKNV和Ah感染，并能提高干擾素調(diào)節(jié)因子7、白介素受體相關(guān)激酶、溶菌酶和IgM等免疫相關(guān)基因表達(dá)[11]。亞單位疫苗因其不含病原微生物的核酸，安全性較好，與此同時(shí)去除了一些不能產(chǎn)生保護(hù)性免疫的抗原，避免抗原之間的相互競(jìng)爭(zhēng)，減少超敏反應(yīng)的發(fā)生，提高了免疫效果，因而備受青睞。

3 菌蛻疫苗

細(xì)菌菌蛻不含細(xì)胞質(zhì)和核酸成分，具有全部細(xì)菌表面抗原，并能作為自身佐劑的一種新型疫苗，由于其細(xì)胞膜上的抗原決定簇與活菌幾乎相同，所以菌蛻疫苗能激起機(jī)體廣泛地免疫反應(yīng)，如黏膜免疫和細(xì)胞免疫，而菌蛻作為自身佐劑的主要成分是因?yàn)槠浼?xì)胞膜上含有免疫細(xì)胞能識(shí)別的特異性受體，這些具有受體能被巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞識(shí)別，增加非特異性免疫的強(qiáng)度。

目前對(duì)于Ah菌蛻疫苗的研究主要是在國(guó)內(nèi)，在2008年，儲(chǔ)衛(wèi)華等利用含有裂解基因E的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Ah中，通過溫度誘導(dǎo)28 ℃升逐漸至42 ℃，并且每隔15 min檢測(cè)1次其溶菌動(dòng)力學(xué)，并做無菌檢驗(yàn)，掃描電鏡觀察大部分菌體誘導(dǎo)成菌蛻，16 h后經(jīng)過試驗(yàn)和檢測(cè)后，證實(shí)沒有活菌的存在。用獲得的菌蛻進(jìn)行免疫銀鯽，在第5～7周產(chǎn)生效價(jià)達(dá)27凝集抗體，而甲醛滅活組僅在第5周產(chǎn)生效價(jià)為26的凝集抗體，菌蛻組和甲醛滅活組均能對(duì)Ah的強(qiáng)毒產(chǎn)生保護(hù)作用，保護(hù)效率分別是78.95%和57.9%，這些結(jié)果都顯示，菌蛻疫苗具有較好的保護(hù)作用[12]。而同一研究小組的Tu用含有嗜水氣單胞菌菌蛻(AHG)、甲醛滅活苗(FKC)和磷酸鹽緩沖液(PBS)的飼料對(duì)異育銀鯽進(jìn)行免疫后，發(fā)現(xiàn)AHG組的血清和腸黏液中的抗體顯著高于其他兩個(gè)組，而且用Ah強(qiáng)毒暴露后，AHG組的存活率顯著高于其他兩個(gè)組，顯示較高的保護(hù)率[13]。在2016年，李紹戊等通過使用不同濃度的重組噬菌體E基因質(zhì)粒來進(jìn)行構(gòu)建菌蛻疫苗，發(fā)現(xiàn)不同濃度的E基因質(zhì)粒均能高效的誘導(dǎo)Ah的裂解，獲得的Ah菌蛻疫苗進(jìn)行免疫鯉魚后發(fā)現(xiàn)能顯著提高血清抗體水平，并且保護(hù)效率高于滅活疫苗[14]。

4 展望

Ah新型疫苗的研究，在近些年取得了很多成果，特別免疫保護(hù)方面都有了很大的提升。隨著禁用抗生素的呼聲越來越強(qiáng)烈，疫苗防病將在養(yǎng)殖中扮演越來越重要的角色。Ah作為一種致病菌，除抗生素外最好的防治方法就是疫苗免疫。Ah膜表面有較多的抗原位點(diǎn)，因而具有較大的制備高保護(hù)疫苗的潛力，并且隨著CRISPR基因編輯技術(shù)在細(xì)菌疫苗中的應(yīng)用[15]以及最近北京大學(xué)對(duì)疫苗研究的新思路[16]，制備出更高保護(hù)率的疫苗來防控Ah將很快實(shí)現(xiàn)。

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征訂啟事

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《中國(guó)獸醫(yī)雜志》編輯部

2016-12-29

國(guó)家自然科學(xué)基金(30972191)；農(nóng)業(yè)部948項(xiàng)目(2014Z34)；吉林省留學(xué)人員創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(201523)

尹玉偉(1992-)，男，碩士生，從事動(dòng)物疾病及免疫研究，E-mail：yuweiyin92@yeah.net

李月紅，E-mail：liyhong@sina.com

S943

A

0529-6005(2017)07-0078-03