李穎鑫 ， 霍彩云 ， 肖 凱 ， 倪子欣 ， 唐玉玲 ， 王昭華 ， 胡艷欣

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京海淀100193)

唾液酸受體在家禽腎和生殖系統(tǒng)組織中的表達(dá)

李穎鑫 ， 霍彩云 ， 肖 凱 ， 倪子欣 ， 唐玉玲 ， 王昭華 ， 胡艷欣

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京海淀100193)

為了觀察流感病毒唾液酸α2,3-半乳糖和唾液酸α2,6-半乳糖兩種受體在雞、鴨兩種家禽腎臟和生殖系統(tǒng)組織中分布和表達(dá)的特征, 本研究利用凝集素免疫熒光組織染色方法對(duì)各器官組織進(jìn)行了系統(tǒng)的定性分析。結(jié)果顯示，唾液酸α2,3-半乳糖和唾液酸α2,6-半乳糖這兩種受體在雞、鴨腎臟和生殖系統(tǒng)中皆有分布，其中唾液酸α2,3-半乳糖的分布更為廣泛。這一研究結(jié)果提示，雞、鴨腎臟和生殖系統(tǒng)組織細(xì)胞對(duì)禽流感病毒和人流感病毒都存在易感的基礎(chǔ)，且更容易感染禽源的流感病毒。

流感病毒 ； 唾液酸受體 ； 腎 ； 生殖系統(tǒng) ； 凝集素 ； 免疫熒光

流感病毒屬于正黏病毒科，流感病毒屬，是有囊膜的RNA病毒，根據(jù)其內(nèi)部核蛋白(nucleoprotein, NP)和基質(zhì)蛋白(matrix protein, M)抗原性的不同，可分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。流感病毒可引起人、禽、豬、馬、蝙蝠等多種動(dòng)物感染和發(fā)病，是人流感、禽流感、豬流感、馬流感等人與動(dòng)物疫病的病原。這些疫病典型的臨床癥狀是急性高熱、全身疼痛、顯著乏力和呼吸道癥狀。流行性感冒(influenza, flu)在世界各地常會(huì)有周期性的大流行，病毒的快速傳播以及較高的發(fā)病率和致死率給人類和動(dòng)物的健康造成了巨大的威脅。除了世界性大流行外，每年的季節(jié)性流行性感冒也造成了大量的發(fā)病率和死亡率。

流感病毒感染宿主的第一步是病毒表面HA 識(shí)別宿主細(xì)胞表面的受體并與其結(jié)合[1]。流感病毒的受體為含唾液酸(sialic acid, SA)的糖鏈，對(duì)病毒的宿主特異性和組織嗜性起到重要的決定性作用[2]。SA 廣泛存在于生物體內(nèi)，常以高伸縮狀態(tài)通過糖苷鍵(α2,3、α2,6 或 α2,8)連接于糖鏈末端[3]。不同物種、不同器官、不同細(xì)胞表面的唾液酸分子類型及糖苷鍵類型不盡相同。目前被普遍接受的流感病毒受體主要有兩種，唾液酸α2,3-半乳糖(Galactose, Gal)(SAα2,3Gal)和唾液酸α2,6-半乳糖(SAα2,6Gal)。人流感病毒主要識(shí)別末端為α2,6Gal的糖鏈?zhǔn)荏w，其主要存在于人類的上呼吸道，而禽流感病毒主要識(shí)別末端為α2,3Gal的糖鏈?zhǔn)荏w，其廣泛存在于人類的下呼吸道及禽類的胃腸道[4]。研究表明，除了糖苷鍵類型外，宿主體內(nèi)唾液酸受體的分布、類型、分子構(gòu)象均是決定流感病毒能否感染的關(guān)鍵因素[5]。這種受體分布不同被認(rèn)為是流感病毒在禽類和人之間跨種屬傳遞的主要障礙。接骨木凝集素( Sambucus nigra agglutinin，SNA)能夠與SAα2,6Gal特異性結(jié)合，而山槐凝集素(Maackia amurensis agglutinin, MAA)則能夠與SAα2,3Gal特異性結(jié)合[6]。

禽或人的呼吸道和消化道各解剖部位流感病毒SA受體分布已被廣泛報(bào)道，泌尿和生殖系統(tǒng)組織SA的表達(dá)和分布鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)選取雞、鴨這兩種家禽的腎和生殖系統(tǒng)組織，應(yīng)用免疫熒光染色法檢測(cè)上述各解剖部位SAα2,3Gal和SAα2,6Gal受體的分布情況，初步探討雞、鴨流感病毒SA受體的表達(dá)，為進(jìn)一步了解禽流感宿主噬性研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù) 。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 140日齡白羽肉雞(雌雄各1只)，購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院牧場(chǎng)。120日齡北京鴨(雌雄各1只)，購自北京宏光鴨場(chǎng)。

1.1.2 試劑 熒光素標(biāo)記植物凝集素SNA、MAA購自Vector Laboratories公司；抗熒光衰減封片劑(含DAPI)，購自北京索萊寶科技有限公司；進(jìn)口羊血清工作液，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)取材 頸動(dòng)脈放血處死雞、鴨，無菌采集其腎臟及部分生殖系統(tǒng)組織，10%的福爾馬林溶液固定24 h后經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋后，制備成3 μm厚的切片，用于免疫熒光染色，每個(gè)組織取2張切片，分別用于滴加生物素標(biāo)記的凝集素SNA和MAA。

1.2.2 免疫熒光染色 切片用二甲苯及梯度酒精常規(guī)脫蠟水化后，蒸餾水沖洗1次，PBS浸洗3次，每次5 min，滴加進(jìn)口羊血清工作液，室溫避光靜置20 min后分別滴加生物素標(biāo)記的凝集素SNA和MAA，前者特異性標(biāo)記SAα2,6Gal 受體，后者特異性標(biāo)記SAα2,3Gal受體，室溫避光孵育1h。經(jīng)PBST洗滌3次，每次5min，再滴加含DAPI的抗熒光衰減封片劑進(jìn)行封片。

1.2.3 顯微鏡觀察 用熒光顯微鏡(OLYMPUS TH4-200)觀察免疫熒光染色后的各組腎和生殖系統(tǒng)組織切片，出現(xiàn)綠色熒光即為陽性信號(hào)。

2 結(jié)果

2.1 雞腎和生殖系統(tǒng)組織流感病毒唾液酸受體的表達(dá) 采用免疫熒光染色的方法對(duì)雞腎和生殖系統(tǒng)組織中SA受體的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。如中插彩版圖1和中插彩版圖2所示，雌性和雄性雞腎小管上皮細(xì)胞分布有大量SAα2,3Gal受體和微量的SAα2,6Gal受體。在輸卵管黏膜下層、子宮黏膜上皮細(xì)胞、睪丸的精原細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞表面均分布有SAα2,3Gal和SAα2,6Gal兩種受體。

2.2 鴨腎和生殖系統(tǒng)組織流感病毒唾液酸受體的表達(dá) 采用免疫熒光染色的方法對(duì)鴨腎和生殖系統(tǒng)組織中SA受體的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。如中插彩版圖3和中插彩版圖4所示，腎小管上皮細(xì)胞分布有大量SAα2,3Gal受體，且雌性腎組織中的MAA陽性信號(hào)強(qiáng)度顯著高于雄性。在卵巢基質(zhì)、睪丸間質(zhì)細(xì)胞核陰莖海綿體中均有SAα2,3Gal受體的分布，在這些組織中亦可見SAα2,6Gal受體的分布，免疫熒光陽信信號(hào)顯著弱于SAα2,3Gal受體。與其他的組織不一樣的是，輸卵管中SAα2,6Gal受體的分布比SAα2,3Gal受體更為廣泛。

3 討論

不同來源的流感病毒與宿主細(xì)胞表面受體之間的特異性相互作用被認(rèn)為是決定流感病毒能否入宿主細(xì)胞以及跨種屬傳播的重要因素之一。基因進(jìn)化分析表明，歷史上幾次大流感病毒株部分或全部基因片段來源于禽流感病毒[7]，其中豬在其形成過程中起非常重要的作用。豬氣管存在能與禽流感病毒特異性結(jié)合的SAα2,3Gal受體,又存在能與人流感病毒結(jié)合的SAα2,6Gal受體,禽流感病毒與人流感病毒均可感染豬,易通過基因重組形成新病毒株,并可能跨越種間屏障感染人類,在人類形成大流行的潛能，因此豬被認(rèn)為是“基因混合器”[8]。

1997年首次報(bào)道的H5N1高致病性禽流感病毒在香港直接從雞傳染到人的事實(shí)證明了禽流感病毒是可以直接通過雞感染人類的[9]。流感病毒唾液酸受體結(jié)合特異性在流感病毒種屬范圍限制中起重要作用。近年來，科學(xué)家們?cè)噲D通過對(duì)不同組織的唾液酸分布差異性進(jìn)行研究，期望能夠從中找到病毒跨種傳播的原因。但是，多數(shù)人的研究僅僅停留在了消化道與呼吸道上面，或者只分析了組織中某一種細(xì)胞的受體存在情況，導(dǎo)致了組織內(nèi)唾液酸分布研究缺乏系統(tǒng)性[10]。本試驗(yàn)從流感病毒HA與宿主細(xì)胞SA受體特異性結(jié)合為切入點(diǎn)，系統(tǒng)地檢測(cè)雞、鴨腎臟和生殖系統(tǒng)SAα2,6Gal和SAα2,3Gal受體。試驗(yàn)結(jié)果表明，除了被人重視的呼吸道和消化道外，雞、鴨的腎臟和生殖系統(tǒng)組織中同樣含有SAα2,6Gal及SAα2,3Gal受體，這些組織同樣不容忽視，而同時(shí)含有兩種受體，易與禽流感病毒和人流感病毒結(jié)合，有利于多種亞型流感病毒的共同感染，也為病毒侵入和基因重組提供了機(jī)會(huì)。臨床癥狀表明，產(chǎn)蛋雞感染高致病性禽流感病毒或中低致病性禽流感病毒，均可引起產(chǎn)蛋量下降，產(chǎn)異常蛋增多。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) SAα2,3Gal和SAα2,6Gal受體在雞生殖系統(tǒng)中的存在，通過兩種受體在雞生殖系統(tǒng)中分布的檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)病毒結(jié)合機(jī)體的主要部位，為研究母雞感染禽流感病毒后產(chǎn)蛋異常的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。有試驗(yàn)證明，H9N2 禽流感病毒能通過種蛋-胚體-雛禽途徑垂直傳播給后代，但是垂直傳播過程中的作用機(jī)制并沒有進(jìn)行系統(tǒng)的研究[11]，本試驗(yàn)也可作為基礎(chǔ)深入探究禽流感病毒垂直傳播的機(jī)制。

野生水禽(包括鴨)是甲型流感病毒“自然基因庫”，同時(shí)其在病毒生態(tài)學(xué)和增殖中起重要作用。野生水禽的甲型流感病毒可偶爾傳遞到其他禽類和哺乳動(dòng)物(包括人)，引起嚴(yán)重疾病的暴發(fā)[12]。隨著養(yǎng)禽業(yè)的飛速發(fā)展，流感病毒的自然宿主也越來越復(fù)雜，禽流感病毒感染水禽的幾率增大，病毒經(jīng)過長期復(fù)制后能夠發(fā)生變異成為感染性的新亞型病毒。所以除了雞群之外，我們也需要長期監(jiān)測(cè)鴨群中禽流感病毒的流行動(dòng)態(tài)，提前預(yù)防禽流感的暴發(fā)。

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Expression of sialic acid receptors in poultry kidney and reproductive system

LI Ying-xin , HUO Cai-yun , XIAO Kai , NI Zi-xin , TANG Yu-ling , WANG Zhao-hua , HU Yan-xin

(College of Veterinary Medicine, China Agricultural University,Beijing 100193，China)

In order to observe the distribution and expression of sialic acid receptor for influenza virus in kidney and reproductive system tissues of chickens and ducks，the qualitative analysis of various tissue sections was performed by using lectin histochemistry method. The results showed that the SAα2, 3 Gal and SAα2, 6 Gal receptors could be detected in both kidney and reproductive system of chickens and ducks. And the distribution of SAα2, 3 Gal was more widespread than SAα2, 6. These results suggest that the tissue cells of kidney and reproductive systes of chickens and ducks are susceptible to both avian and human influenza viruses, which seems to be easier to be infected by avian influenza viruses.

influenza virus ; sialic acid receptor ; kidney ; reproductive system ; agglutinin Immunofluorescence

HU Yan-xin

2017-03-28

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃課題(2015BAD12B01)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(2017DY003)

李穎鑫(1995-)，女，本科生，就讀于動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)，E-mail：649966729@qq.com

胡艷欣，E-mail：huyxcau@cau.edu.cn

S852.32

A

0529-6005(2017)07-0013-03