胡廷章，秦 娟，陳再剛，黃小云

(重慶三峽學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶 404100)

番茄轉(zhuǎn)錄因子基因SlYAB2 a 的克隆、表達(dá)及亞細(xì)胞定位分析

胡廷章，秦 娟，陳再剛，黃小云

(重慶三峽學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶 404100)

為了研究番茄SlYAB2a基因的功能及其在番茄生長(zhǎng)發(fā)育中的分子機(jī)理，以番茄的cDNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)從番茄中克隆到SlYAB2a基因，該基因編碼的蛋白質(zhì)由192個(gè)氨基酸殘基組成，蛋白質(zhì)的分子量為21.35 kDa，等電點(diǎn)是8.79，平均親水系數(shù)是-0.487。SlYAB2a蛋白質(zhì)的6～165位氨基酸殘基形成Pfam：YABBY結(jié)構(gòu)域，在20～47位有1個(gè)C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域，在122～181位有1個(gè)螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明SlYAB2a蛋白分子中，α-螺旋占19.79%、β-折疊占14.06%、其余66.15% 為不規(guī)則卷曲。蛋白多序列比對(duì)表明SlYAB2a與馬鈴薯、林煙草、釀酒葡萄、大豆、擬南芥、甘藍(lán)型油菜、花藥野生稻、玉米和小麥YABBY2的一致性分別為98%，78%，71%，65%，64%，64%，58%，57%，57%，說(shuō)明SlYAB2a蛋白與來(lái)源于雙子葉植物的YABBY2一致性較高，而與來(lái)源于單子葉植物的一致性較低。通過(guò)聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)YABBY2蛋白明顯分為單子葉和雙子葉2個(gè)亞類(lèi)，SlYAB2a蛋白屬于雙子葉亞類(lèi)，與馬鈴薯、潘那利番茄、絨毛狀煙草、林煙草等的YABBY2蛋白序列親緣關(guān)系較近。實(shí)時(shí)定量RT-PCR 分析結(jié)果表明，在番茄植物的不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，根、莖、葉、花、果實(shí)中，都有SlYAB2a基因表達(dá)；并且在花和青熟果實(shí)中，SlYAB2a基因表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織。說(shuō)明SlYAB2a基因在花和果實(shí)的發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果表明SlYAB2a蛋白定位于細(xì)胞核中。

番茄；SlYAB2a；基因克??；表達(dá)分析；亞細(xì)胞定位

高等植物的葉和花屬于側(cè)生器官，極性建立的過(guò)程是側(cè)生器官形態(tài)建成中的核心問(wèn)題，也是植物發(fā)育生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。側(cè)生器官的形成起始于植物的頂端分生組織，器官分化過(guò)程中需要建立基-頂軸、近-遠(yuǎn)軸和中-側(cè)軸3個(gè)體軸極性[1]。在側(cè)生器官發(fā)育中，近-遠(yuǎn)軸分化非常關(guān)鍵，因此，這一過(guò)程的研究備受關(guān)注。在植物中已經(jīng)分離出一系列在近-遠(yuǎn)軸極性建立中起重要作用的基因。如MYB 家族中的PHAN和AS1 基因及其同源異型結(jié)構(gòu)域-亮氨酸拉鏈蛋白基因PHB、PHV、REV促進(jìn)近軸面分化；KAN 家族中KAN1、KAN2、KN3基因和YABBY 家族中的YAB2、YAB3、FIL、CRC基因與側(cè)生器官遠(yuǎn)軸面的分化有關(guān)，這類(lèi)基因的突變將導(dǎo)致側(cè)生器官極性分化功能喪失和異常側(cè)生分生組織形成[2]。

YABBY是種子植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，在控制側(cè)生器官遠(yuǎn)-近軸極性建立中發(fā)揮重要作用，參與植物葉、枝和花的發(fā)育[3]。已經(jīng)從擬南芥[4-5]、水稻[6-7]、小麥[8]、玉米[9]、大白菜[10]、箭葉淫羊藿[11]、豌豆[12]、菜薹[13]等許多植物中分離到Y(jié)ABBY基因家族成員。YABBY家族基因編碼一段N端含有1個(gè)C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域且C端含有1個(gè)螺旋-環(huán)-螺旋YABBY結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子[4]。擬南芥植物有CRC、FIL(YAB1)、YAB2、YAB3、INNER NO OUTER(INO)和YAB5 6個(gè)YAB基因家族成員，分為CRC、YAB2、FIL/YAB3、INO和YAB5 5個(gè)亞家族。根據(jù)基因的表達(dá)模式也將5個(gè)亞家族分為兩類(lèi)：一類(lèi)包含CRC和INO，它們只在花器官中表達(dá)；而另一類(lèi)包括FIL、YAB2和YAB5，它們也在營(yíng)養(yǎng)組織中表達(dá)[14]。酵母雙雜交研究表明，擬南芥營(yíng)養(yǎng)組織表達(dá)的YAB2、YAB3和YAB5蛋白可以與SLK1、SLK2和SLK3蛋白互作，F(xiàn)IL、YAB3和YAB5與LUG 和LUH可以互作[15]。LUG-YAB復(fù)合物阻止KNOX在葉中表達(dá)，LUG-YAB也可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子CUC活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)LAS基因；LUG-YAB復(fù)合物也調(diào)控KANs、ETT/ARF4基因。LUG-YAB復(fù)合物在保持葉的極性和分生組織活性上發(fā)揮作用[15]。

本試驗(yàn)以番茄(SolanumlycopersicumMill.Cv.Ailsa Craig，AC++)為試材，根據(jù)查找到的SlYAB2a基因候選序列，克隆到SlYAB2a基因的cDNA序列，分析了該基因編碼的蛋白序列，進(jìn)一步檢測(cè)了SlYAB2a基因的表達(dá)模式及其表達(dá)蛋白的亞細(xì)胞定位。

1 材料和方法

1.1 植物試材及其SlYAB2a基因的克隆

試驗(yàn)在重慶三峽學(xué)院園藝植物生理生化實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，試驗(yàn)時(shí)間為2014 年3-10 月。將番茄種子播種到裝有營(yíng)養(yǎng)土的花缽中，于自然條件下生長(zhǎng)。分別取番茄幼苗的根、莖、葉，以及成苗植株的成熟葉、花、青熟期果實(shí)和成熟紅果，用于提取RNA。

采用TRIzol法提取各個(gè)組織的總RNA，RNAase-Free H2O 溶解RNA，利用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定其濃度和純度，用1.0%變性瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果判斷RNA的完整性。SuperscriptTMⅢ RNase H-Reverse Transcriptase kit(Invitrogen，USA)用于合成cDNA。

根據(jù)查找到的SlYAB2a(Accession No.AK328263) 基因的候選序列，采用在線工具(http：//www.bio-soft.net/sms/)預(yù)測(cè)基因序列的開(kāi)放閱讀框(ORF)，在ORF 兩端設(shè)計(jì)擴(kuò)增編碼區(qū)的上游引物YAB2a F(5′-CTTTTACTTCTAATTCTTCGATCCG-3′)和下游引物YAB2a R(5′-TAATTAATAGAGACCAATTGTTTTC-3′)，以番茄幼苗的cDNA為模板進(jìn)行SlYAB2a基因CDS 序列的擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，32次循環(huán)；72 ℃延伸5 min。用1% 瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收預(yù)期大小的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、轉(zhuǎn)化和測(cè)序鑒定。

1.2SlYAB2a序列分析及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

SlYAB2a基因核苷酸翻譯采用序列處理在線工具(http：//www.bio-soft.net/sms)，用SMART進(jìn)行蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域分析(http：//smart.embl-heidelberg.de/)，氨基酸成分、蛋白分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂溶指數(shù)和親水系數(shù)利用在線工具(http：//web.expasy.org/protparam)，一致性和同源性計(jì)算利用NCBI網(wǎng)站GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的Blast程序(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，在線構(gòu)建蛋白親水性圖譜(http：//ipsort.hgc.jp)、預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)(http://www.ibi.vu.nl/programs)和預(yù)測(cè)蛋白的胞內(nèi)定位(http：//wolfpsort.seq.cbrc.jp/)，多序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建采用在線工具(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)。

1.3 RT-PCR檢測(cè)SlYABa基因的表達(dá)

以cDNA為模板，用引物YAB2a qf(5′-ATCATC ATCCTCTTCTACAA-3′)和 YAB2a qr(5′-TTGCTTG CCTTTATCCTTTG-3′)進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，擴(kuò)增SlYAB2a基因片段的長(zhǎng)度為165 bp。以番茄Actin基因作為內(nèi)標(biāo)基因同時(shí)進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，參照GenBank中番茄的Actin序列(U60480)，設(shè)計(jì)引物ActinF(5′-TGAAATGTGACGTGGATATTAGG-3′)和ActinR(5′-TGAGGGAAGCCAAGATAGAGC-3′)，擴(kuò)增的ACTIN1基因片段長(zhǎng)度應(yīng)為201 bp。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和引物的特異性。定量PCR分析的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參考胡廷章等[16]的方法，所有PCR 反應(yīng)都設(shè)3次重復(fù)。

1.4 SlYAB2a 的亞細(xì)胞定位

依據(jù)SlYAB2a基因序列，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)SacⅠ的上游引物YAB2a yf(5′-AATGCGAGCTCCTTTTAC TTCTAATTCTTCGATCCG-3′)和酶切位點(diǎn)BamH Ⅰ的下游引物YAB2a yr(5′- AATCGGGATCCATAGAG ACCAATTGTTTTC-3′)，擴(kuò)增基因的編碼序列，克隆到pCAMBIA1301-GFP 載體的SacⅠ/BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)之間，得到pCAMBIA1301-SlYAB2a-GFP重組表達(dá)載體。利用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[17]。28 ℃孵育24 h 后，用共聚焦顯微鏡(Nikon Eclipse TE2000-E)觀察和拍照，照片的分析和處理采用EZ-C1 software 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 克隆SlYAB2a基因全長(zhǎng)cDNA 序列

利用RT-PCR技術(shù)，從番茄幼苗中擴(kuò)增出預(yù)期大小的序列片段(圖1)。測(cè)序結(jié)果表明，分離到的片段長(zhǎng)度為 636 bp，與預(yù)測(cè)的序列一致。證明克隆到的片段為所需的目的片段，命名為SlYAB2a。

2.2 SlYAB2a蛋白質(zhì)特性分析

利用生物學(xué)信息軟件分析SlYAB2a 蛋白質(zhì)特性。番茄SlYAB2a包含1個(gè)579 bp讀碼框，編碼的蛋白肽鏈由192個(gè)氨基酸殘基組成，包含20 種氨基酸，其中Ser為27 個(gè)(14.1%)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于第二的Ile和Pro(都為13 個(gè)，占6.8%)，含量最低是Trp，只有1個(gè)(0.5%)。蛋白肽鏈的分子量為21.35 kDa，等電點(diǎn)是8.79。蛋白的不穩(wěn)定參數(shù)為59.30，屬于典型的不穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)(Aliphatic index)為69.58，是脂溶蛋白。SlYAB2a蛋白的平均親水系數(shù)是-0.487。用在線網(wǎng)站http：//ipsort.hgc.jp構(gòu)建的蛋白親水性圖譜也顯示該蛋白N-末端有2個(gè)疏水區(qū)域，C-末端有3個(gè)親水區(qū)域，且大部分區(qū)域親水性比較強(qiáng)，傾向于親水性的蛋白(圖2)。因此，該蛋白為親水蛋白。分析SlYAB2a蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)表明，SlYAB2a蛋白分子中，α-螺旋占19.79%、β-折疊占14.06%、其余66.15% 為不規(guī)則卷曲。亞細(xì)胞定位分析表明，SlYAB2a 蛋白定位于細(xì)胞核。

1.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。1.DNA Marker；2.Product of RT-PCR.

圖2 SlYABa蛋白的疏水性/親水性分析Fig.2 Hydrophobicity/hydrophilicity profile of SlYAB2a

在NCBI上Blast 分析表明該蛋白與多種植物的YABBY2轉(zhuǎn)錄因子有較高同源性。對(duì)SlYABa 功能域結(jié)構(gòu)分析表明，該蛋白質(zhì)具有YABBY轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)構(gòu)特征，即在6～165位氨基酸具有Pfam：YABBY(PFAM accession number：PF04690)結(jié)構(gòu)域，在靠近N端的20～47位氨基酸有1個(gè)C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域(SMART accession number：SM00184)，在靠近C端122～181位氨基酸有1個(gè)螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域(SMART accession number：SM00674)(圖3)。

圖3 SlYAB2a基因的核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of SlYAB2a gene

★.SlYAB2a；星號(hào).完全相同的氨基酸殘基；冒號(hào).高度保守的氨基酸殘基；圓點(diǎn).不太保守的氨基酸殘基；破折號(hào).為了實(shí)現(xiàn)更好的比對(duì)。GenBank 登錄號(hào)：擬南芥.NP_001077490；甘藍(lán)型油菜.XP_013710950；大豆.XP_006594909；釀酒葡萄.XP_010651638；番茄.XP_004241356；馬鈴薯.XP_006361110；林煙草.XP_009792037；玉米.ACG32970；花藥野生稻.XP_006650352；小麥.ABW80974。

★.SlYAB2a；Asterisk.Identical residues；Colon.Highly conserved residues；Dot.Weakly conserved residues；Dash.Gaps introduced for optimal alignment.The GenBank accession No.Arabidopsisthaliana.NP_001077490；Brassicanapus.XP_013710950；Glycinemax.XP_006594909；Vitisvinifera.XP_010651638；Solanumlycopersicum.XP_004241356；Solanumtuberosum.XP_006361110；Nicotianasylvestris.XP_009792037；Zeamays.ACG32970；Oryzabrachyantha.XP_006650352；Triticumaestivum.ABW80974.

圖4 SlYAB2a與其他植物YABBY2蛋白的氨基酸序列對(duì)比分析
Fig.4 Analysis of Alignment of deduced SlYAB2a protein with other YABBY2 proteins from plants

2.3 SlYAB2a蛋白序列的同源比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

用不同植物來(lái)源YABBY2蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，表明它們的同源性較高(圖4)。在靠近N端的鋅指結(jié)構(gòu)域和在靠近C端的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域比較保守(圖3)。一致性分析表明SlYAB2a與馬鈴薯、林煙草、釀酒葡萄、大豆、擬南芥、甘藍(lán)型油菜、花藥野生稻、玉米和小麥YABBY2的一致性分別為98%，78%，71%，65%，64%，64%，58%，57%，57%。說(shuō)明YABBY2與雙子葉植物YABBY2的一致性高，而與單子葉植物來(lái)源的一致性較低。

為了了解SlYAB2a蛋白與不同植物來(lái)源YABBY2蛋白間的親緣關(guān)系，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明：YABBY2蛋白分為明顯的2個(gè)亞類(lèi)，即單子葉亞類(lèi)和雙子葉亞類(lèi)。SlYAB2a編碼的蛋白屬于雙子葉亞類(lèi)，與馬鈴薯、潘那利番茄、絨毛狀煙草、林煙草等的YABBY2蛋白序列親緣關(guān)系較近(圖5)。

★.SlYAB2a；緊接在物種名后的為蛋白的GenBank上登錄號(hào)。★.SlYAB2a；The accession No.in GenBank is next to the scientific names of the organism.

2.4SlYAB2a在番茄組織中的表達(dá)

定量RT-PCR分析表明，在番茄幼苗的根、莖、幼葉，以及成苗植株的成熟葉、花、青熟果實(shí)和成熟紅果都能檢測(cè)到SlYAB2a基因的表達(dá)，說(shuō)明SlYAB2a基因在番茄植株的不同組織中都能表達(dá)。但SlYAB2a在不同組織中的表達(dá)量存在很大差異。在番茄的根、莖中只有少量的表達(dá)，表達(dá)最低；而在花和青果中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他的組織器官，分別達(dá)到根的74.76，39.90倍；特別是花中的最高，達(dá)到青果的1.87倍(圖6)。說(shuō)明SlYAB2a基因在番茄植物的花和果實(shí)發(fā)育中起著重要作用。

2.5 SlYAB2a蛋白的亞細(xì)胞定位

通過(guò)農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)將載體轉(zhuǎn)化至洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)，結(jié)果表明，被pCAMBIA1301-GFP 載體轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中，在被pCAMBIA1301-SlYAB2a-GFP 載體轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮細(xì)胞中檢測(cè)到綠色熒光只分布在細(xì)胞核中(圖7)，推測(cè)番茄SlYAB2a 蛋白定位于細(xì)胞核。

圖6 實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 分析番茄SlYAB2a基因的表達(dá)模式Fig.6 Quantitative real-time RT-PCR analysis of the expression profiling of SlYAB2a gene

3 結(jié)論與討論

根據(jù)查找到的番茄SlYAB2a基因候選序列，采用RT-PCR技術(shù)從番茄中克隆到SlYAB2a基因的cDNA序列。其推測(cè)的蛋白質(zhì)具有YABBY轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)構(gòu)特征，即有Pfam：YABBY結(jié)構(gòu)域，在靠近N端有1個(gè)C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域，在靠近C端有1個(gè)螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域。說(shuō)明SlYAB2a屬于植物YABBY蛋白家族。同源性分析表明，與SlYAB2a同源性較高的YABBY2蛋白來(lái)源于馬鈴薯、林煙草、釀酒葡萄、大豆、擬南芥。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，SlYAB2a與雙子葉植物的YABBY2蛋白親緣關(guān)系近，而與單子葉植物的YABBY2蛋白親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，與馬鈴薯YABBY2的親緣關(guān)系最近。亞細(xì)胞定位研究表明SlYAB2a蛋白定位于細(xì)胞核。進(jìn)一步說(shuō)明SlYAB2a屬于轉(zhuǎn)錄因子YABBY家族的YABBY2亞家族。

圖7 GFP 和SlYAB2a 基因分別在洋蔥表皮細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)Fig.7 The transient expression of GFP and SlYAB2a gene in onion epidermal cells

已有的研究表明，植物YABBY家族基因的表達(dá)模式各不相同，在植物發(fā)育和形態(tài)建成中具有不同的功能。FIL(YAB1)/YAB3和YAB5亞家族主要參與葉的形態(tài)建成，與雙子葉植物和單子葉禾本植物的葉片發(fā)生有關(guān)[8，18]。擬南芥FIL、YAB2、YAB3和YAB5基因主要在側(cè)生器官遠(yuǎn)軸組織中表達(dá)，它們?cè)诩せ畋由?，抑制頂端分生組織生長(zhǎng)以及葉邊緣形成中是不可或缺的[14，18]。擬南芥FIL是參與正調(diào)控和負(fù)調(diào)控的雙功能轉(zhuǎn)錄因子，控制側(cè)生器官的發(fā)育[19]。擬南芥FIL和YAB3基因突變引起包括葉序畸形的一系列缺陷表型[20]，異位表達(dá)FIL或YAB3基因引起遠(yuǎn)軸型細(xì)胞的異常分化[5]。大白菜的BraYAB1-702基因在擬南芥中的異位表達(dá)，引起擬南芥葉彎曲，抑制SAM，延遲花期[10]。菜薹CtYABBY1是雄性不育的負(fù)調(diào)控基因，也是溫度敏感基因，低溫處理可以提高該基因的表達(dá)，恢復(fù)植物的繁殖能力[13]。小麥TaYAB1基因和野生葡萄VpYABBY1基因在擬南芥中的表達(dá)引起葉片近軸面細(xì)胞趨向于遠(yuǎn)軸面的特征[8，21]。水稻YAB3是葉細(xì)胞生長(zhǎng)和分化不可缺少的[7]；水稻TOB1屬于YAB3亞家族，在水稻小穗發(fā)育中起重要作用[22]。擬南芥CRC在蜜腺及心皮遠(yuǎn)軸面中特異表達(dá)，控制蜜腺及心皮的發(fā)育[4，23]。豌豆CRC控制心皮、柱頭和蜜腺的發(fā)育[12]。花菱草基因EsCRC在心皮的發(fā)育和萼片的形成中起著重要作用[11]。水稻基因DROOPING LEAF(DL)屬于CRC/DL亞家族，DL突變體表現(xiàn)為心皮轉(zhuǎn)化為雄蕊和葉片的中脈缺失[6，24]。擬南芥INO在外珠被層表達(dá)，INO亞家族主要參與遠(yuǎn)軸端外珠被的形態(tài)建成，在被子植物外被形成過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[25]。已有的研究結(jié)果表明，YABBY家族基因在種子植物形態(tài)建成中發(fā)揮重要作用，YABBY參與植物側(cè)生器官葉和花的發(fā)育。

在本研究定量PCR分析結(jié)果表明，SlYAB2基因在番茄的根、莖、葉、花和果實(shí)中均有表達(dá)，但在花和青果中的表達(dá)明顯高于其他的組織器官?；蛟诮M織器官中的表達(dá)與其行使的功能是密切相關(guān)的。當(dāng)1個(gè)基因在某一組織或器官中特異表達(dá)或表達(dá)顯著高于其他部位時(shí)，該基因往往在這一組織或器官行使的功能是不可或缺的。由于YABBY家族基因在種子植物形態(tài)建成中發(fā)揮重要作用。因此，有理由相信SlYAB2a轉(zhuǎn)錄因子在番茄花和果實(shí)發(fā)育的調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。下一步將通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，驗(yàn)證SlYAB2a在植物體內(nèi)的生理功能。

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Cloning，Expression and Subcellular Localization Analysis of SlYAB 2 a Gene from Tomato

HU Tingzhang，QIN Juan，CHEN Zaigang，HUANG Xiaoyun

(School of Life Science and Engineering，Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404100，China)

In order to study the function and molecular mechanism ofSlYAB2ain growth and development of tomato.The cDNA sequence ofSlYAB2awas cloned from tomato by RT-PCR.Bioinformatics analysis showed thatSlYAB2aencodes a putative polypeptide of 192 amino acids with a calculated molecular mass of 21.35 kDa，a theoretical pI of 8.79，and a grand average of hydropathy value of-0.487.SlYAB2a protein was predicted to possess a Pfam：YABBY domain architecture at position 6-165，a C2C2zinc finger-like domain at position 20-47，and a helix-loop-helix domain at position 122-181.Secondary structure analysis revealed that SlYAB2a protein contains 19.79% α-helical domains，14.06% β-sheet domains，and 66.15% random coil.The analysis of protein multiple sequence alignments showed that the percent identity of the SlYAB2a with members of group YABBY2 fromSolanumtuberosum，Nicotianasylvestris，Vitisvinifera，Glycinemax，Arabidopsisthaliana，Brassicanapus，Oryzabrachyantha，ZeamaysandTriticumaestivumwere 98%，78%，71%，65%，64%，64%，58%，57% and 57%，respectively；which suggested the percent identity of the SlYAB2a with other members of group YABBY2 from dicotyledon was higher than that from monocotyledon.The analysis of phylogenetic relationship showed that YABBY2 was easily separated into two distinct subgroups，that was dicotyledon subgroup and monocotyledon subgroup.SlYAB2a belonged to dicotyledon subgroup and was most closely related to members of group YABBY2 fromSolanumtuberosum，Solanumpennellii，NicotianatomentosiformisandNicotianasylvestris.The expression ofSlYAB2awas determined by Real-time quantitative RT-PCR.The result showed that theSlYAB2agene was transcribed in different tissue organ.The expression level ofSlYAB2ain flowers and mature green fruits was much higher than that in any other analyzed tissue organs.These results suggested that SlYAB2a might be involved in flower and fruit development.Following transient expression of SlYAB2a in onion epidermal cells，SlYAB2a was found to be localized in the nucleus.

Tomato；SlYAB2a；Gene cloning；Expression analysis；Subcellular localization

2016-06-01

重慶市教育委員會(huì)科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(KJ131101)；重慶市萬(wàn)州區(qū)科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目(201403063)；重慶三峽學(xué)院科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(15PY03)

胡廷章(1965-)，男，四川簡(jiǎn)陽(yáng)人，教授，博士，主要從事植物生理生化與分子生物學(xué)研究。

Q78；S641.03

A

1000-7091(2016)06-0076-07

10.7668/hbnxb.2016.06.012