孟想想，閆佳萍，劉曉夢，廖詠玲，常 杰，許 鋒

(1.長江大學 園藝園林學院，湖北 荊州 434025；2.靶向抗腫瘤藥物湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 荊門 448000；3.荊楚理工學院 化工與藥學院，湖北 荊門 448000)

羅馬洋甘菊HMGR基因的克隆與表達分析

孟想想1，閆佳萍1，劉曉夢1，廖詠玲1，常 杰2，3，許 鋒1

(1.長江大學 園藝園林學院，湖北 荊州 434025；2.靶向抗腫瘤藥物湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 荊門 448000；3.荊楚理工學院 化工與藥學院，湖北 荊門 448000)

3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA還原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR)是植物萜類化合物甲羥戊酸合成途徑中的關鍵限速酶。為研究HMGR基因在洋甘菊萜類化合物合成代謝中的功能，根據(jù)前期羅馬洋甘菊轉錄組注釋HMGR的Unigene序列設計引物，以羅馬洋甘菊cDNA為模板，采用RT-PCR方法，從羅馬洋甘菊中克隆得到一個長為1 856 bp的HMGR基因，命名為CnHMGR(GenBank登錄號為KU589282)。CnHMGR基因序列包含1個1 746 bp長的開放閱讀框，編碼582個氨基酸，生物信息學軟件預測蛋白質分子量和等電點分別為62.5 kDa和6.80。氨基酸序列多重比對結果顯示，CnHMGR蛋白質與其他植物的HMGR蛋白具有高度相似性，并包含HMGR蛋白質家族中的2個HMG-CoA結合基序：TTEGCLUA、EMPVGYVQIP以及2個NADP(H)結合基序：TVGGGT、DAMGMNM，表明CnHMGR屬千羅馬洋甘菊HMGR家族成員。組織表達分析顯示CnHMGR在羅馬洋甘菊的不同組織均有表達，在花中表達量最高，在莖中表達量最低。通過對CnHMGR基因的克隆及表達特性分析，為后續(xù)深入研究其在洋甘菊倍半萜合成途徑中的功能奠定了理論基礎。

羅馬洋甘菊；CnHMGR；基因克??；組織表達

羅馬洋甘菊(Chamaemelumnobile)為菊科母菊屬草本植物，富含揮發(fā)性芳香油[1]。研究表明，洋甘菊揮發(fā)油的主要成分為倍半萜類化合物，包括α-甜沒藥醇、α-甜沒藥醇氧化物A和B以及母菊薁等活性成分，具有消炎、抑菌、抗氧化性和抗癌等功效，被廣泛用于藥品、化妝品和香料等領域。盡管洋甘菊揮發(fā)油主要從花中提取，但花中僅含有1%～2%的揮發(fā)性油[2-3]，遠不能滿足市場需求。因此，提高洋甘菊揮發(fā)油中倍半萜類化合物含量，是目前洋甘菊栽培育種研究領域中的重要方向之一。

植物倍半萜類物質生物合成中的C5單位主要來自甲羥戊酸(MVA)途徑。MVA途徑是合成倍半萜的主要來源，兩分子乙酰CoA(Acetyl-CoA)在乙酰CoA轉運酶(AACT)作用下形成乙酰CoA(Acetoacetyl-CoA)，經羥甲基戊二酰CoA合酶(HMGS)催化形成3-羥基-3-甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)，再在HMGR催化下形成甲羥戊酸(MVA)，之后逐步合成甲羥戊酸-5-磷酸(MVAP)、甲羥戊酸-5-二磷酸(MVAPP)及異戊烯基焦磷酸(IPP)，或其異構體二甲丙烯基焦磷酸(DMAPP)[4]。IPP和DMAPP縮合形成牻牛兒基焦磷酸(GPP)；GPP與1個IPP 單元結合生成法呢基焦磷酸(FPP)為倍半萜的前體物質，F(xiàn)PP經異構、環(huán)化、絡合等方式最終形成倍半萜[5]。在MVA途經中，3-羥基-3-甲基戊二酸單酰CoA還原酶(HMGR)催化3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)生成甲羥戊酸(MVA)，這一催化過程被認為是控制MVA途徑前期反應的關鍵限速步驟[6]，因此HMGR被認為是MVA途徑中的關鍵限速酶之一。大量研究表明：倍半萜類物質的合成與HMGR活性呈正相關，提高植物體內HMGR基因的表達水平可顯著提高倍半萜類物質含量[7]。如Chappell和Nable[8]通過外源真菌誘導煙草懸浮細胞的HMGR酶活性，進而促進了倍半萜類化合物的積累。此外，甜椒HMGR2基因表達水平也受外源真菌誘導，同時倍半萜環(huán)化酶及法尼基焦磷酸合酶的活性也隨之提高，暗示HMGR2基因參與調控甜椒倍半萜類化合物的生物合成[9]。

近年來，科學家已先后從銀杏(Ginkgobiloba)[10]、樂昌含笑(Micheliachapensis)[11]、丹參(Salviamiltiorrhiza)[12]、龍眼(Dimocarpuslongan)[13]、蒲公英(Taraxacummongolicum)[14]、露水草(Cyanotisarachnoidea)[15]、積雪草(Centellaasiatica)[16]等植物中分離克隆出HMGR基因，但迄今為止在羅馬洋甘菊中尚未見HMGR基因的報道。鑒于HMGR是倍半萜類化合物合成途徑中的關鍵限速酶，因此，本研究以羅馬洋甘菊為試材，利用RT-PCR技術克隆CnHMGR基因，并進行了該基因的生物信息學分析，通過實時熒光定量PCR技術檢測CnHMGR在不同組織中的表達水平，以期為進一步開展羅馬洋甘菊CnHMGR基因的表達調控和定向調節(jié)倍半萜類化合物的生物合成奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

試驗材料為種植于長江大學植物園的羅馬洋甘菊。本試驗中引物核苷酸和PCR產物測定序列工作均委托上海生工生物工程公司完成。切膠回收試劑盒(Agarose Gel DNA purifieation Kit Ver.4.0)、RNA提取試劑盒(MiniBEST Plant RNA Extraction kit)、反轉錄試劑盒(PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit)、實時定量試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit Perfect Real Time)、pMD18-T載體、dNTP、RNA酶和TaqDNA聚合酶均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 羅馬洋甘菊CnHMGR基因的克隆

取羅馬洋甘菊的花組織樣品2～3 g，使用液氮研磨成粉狀，并采用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction kit試劑盒提取總RNA，采用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Sythesis Kit(TaKaRa，大連)試劑盒將提取RNA反轉錄成cDNA。根據(jù)許鋒課題組前期羅馬洋甘菊轉錄組注釋的HMGRUnigene序列，設計一對特異引物DFHMGR(5′-CCCACCCCTTCCT

TTGAAAA-3′)和DRHMGR(5′-GGATCAGAAGATGA

TGCCCACA-3′)，利用反轉錄PCR技術(RT-PCR)擴增HMGR基因。PCR擴增產物經過凝膠電泳初步檢測后切膠回收，進一步純化后與pMD-18T載體進行連接，轉化進大腸桿菌株DH5α，挑選陽性克隆送上海生工生物工程公司測序。

1.3 生物信息學分析

經測序成功的HMGR基因序列，利用NCBI網(wǎng)站上的在線軟件Blast P(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行DNA序列相似性比較及蛋白質序列分析，利用軟件Vector NTI 11.5預測CnHMGR基因的開放讀碼框(ORF)。采用在線工具ExPASy(http：//web.expasy.org)預測CnHMGR編碼蛋白的理化性質。利用軟件Vector NTI 11.5將CnHMGR蛋白與其他植物HMGR的蛋白質進行多重比對，通過Clustal X2.0和MEGA5構建HMGR蛋白質的系統(tǒng)進化樹。

1.4 實時熒光定量PCR分析

分別提取羅馬洋甘菊根、莖、葉、花的總RNA，反轉錄成cDNA。根據(jù)CnHMGR的cDNA序列設計實時熒光定量PCR特異引物，上游引物為5′-AGAAGAAACCACCTCCAACTATCG-3′，下游引物為5′-CTTCCAGAGGCAATCCTGATAGAG-3′；內參基因選用18S基因，基因上游引物為5′-TTGGTCTCC CGTGCTAATGG-3′，下游引物為5′-CGAAGCGTC ATCCTAAGACAACA-3′。參照TaKaRa公司的SYBR?Premix ExTaqⅡ(TliRNaseH Plus)試劑盒說明書，在Bio-Rad CFX熒光定量PCR儀上進行實時熒光定量PCR。反應程序為95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，共40個循環(huán)，加溶解曲線程序，每個部位均進行3次重復，基因相對表達量值通過2-ΔΔCt法計算[17]，各組織表達水平以莖中的表達量為對照(CK)。

起始密碼子和終止密碼子通過方框標出；引物通過下劃線標出。The initial codon and the stop codon are highlighted in square box；The primer sequences are underlined.

2 結果與分析

2.1CnHMGR全長cDNA克隆和序列分析

根據(jù)本課題組前期羅馬洋甘菊轉錄組注釋的HMGRUnigene序列設計引物，利用RT-PCR擴增得到長為1 856 bp的cDNA序列。經NCBI網(wǎng)站的Blast程序在線比對分析顯示，該cDNA序列與其他植物的HMGR序列高度同源，表明克隆的cDNA序列為羅馬洋甘菊HMGR基因，因此，將該cDNA序列命名為CnHMGR，GenBank登錄號為KU589282。CnHMGR基因的cDNA序列全長1 856 bp，包含1 746 bp的開放閱讀框，編碼582個氨基酸(圖1)。2.2 CnHMGR蛋白質分析ExPASy在線分析結果顯示，CnHMGR基因編碼的蛋白質分子量為62.5 kDa，理論等電點為6.80。利用軟件Vector NTI11.5將CnHMGR蛋白質序列與其他植物HMGR蛋白序列進行多重比對，結果顯示CnHMGR與其他植物的HMGR蛋白序列高度同源(圖2)。如表1所示，CnHMGR與蒼術(Atractylodeslancea)、三七(Panaxnotoginseng)、甜瓜(Cucumismelo)、荔枝(Litchichinensis)、橡膠樹(Heveabrasiliensis)、蓮花(Nelumbonucifera)、葡萄(Vitisvinifera)、黃瓜(Cucumissativus)、蓖麻(Ricinuscommunis)HMGR蛋白質的相似度分別為85%，78%，80%，79%，79%，78%，78%，77%，77%，進一步驗證了CnHMGR為羅馬洋甘菊HMGR基因家族成員之一。進一步的序列分析結果顯示，CnHMGR蛋白包含4個保守的結構域，分別為2個NADP(H)結合域：TVGGGT、DAMGMNM，以及2個HMG-CoA結合域：TTEGCLVA、EMPVGYVQIP，暗示CnHMGR也具有與其他植物HMGR蛋白酶相似的催化功能[18]。

表1 CnHMGR與其他植物HMGR蛋白質序列的相似性比對Tab.1 Protein sequence of CnHMGR similarity to HMGRs of other plant species

保守的HMG-CoA結合基序與NADP(H)結合基序用黑框標出。The conserved NADP(H)-binding motifs and HMG-CoA-binding domains is highlighted in black square box.

2.3 CnHMGR系統(tǒng)進化分析

利用軟件ClustalX 2.0和MEGA 6.0通過鄰接法(Neighbor-joining)構建了HMGR的系統(tǒng)進化樹。HMGR系統(tǒng)進化樹分成兩大分支，單子葉植物禾本科和雙子葉植物，雙子葉植物又被分為菊科、桔?？?、藍果樹科、五加科、茄科、玄參科、唇形科、十字花科、無患子科和大戟科。在HMGR系統(tǒng)進化上，羅馬洋甘菊與雙子葉植物的親緣關系較單子葉植物近，與菊科植物萬壽菊(Tageteserecta)親緣關系最近、與桔梗(Platycodongrandiflorus)、喜樹(Camptothecaacuminata)、三七(Panaxnotoginseng)和人參(Panaxginseng)也有很高的親緣性(圖3)，這一方面反映了CnHMGR基因在雙子葉植物中進化保守，另一方面也反映了植物HMGR基因在進化上的多樣性，這與植物形態(tài)學分類情況是一致的。

圖中各分支數(shù)值代表置信度。The number shown at each branch indicates the bootstrap values.

2.4CnHMGR組織表達分析

提取羅馬洋甘菊的根、莖、葉、花的總RNA，利用實時熒光定量PCR技術(qRT-PCR)測定了羅馬洋甘菊各器官中CnHMGR基因的表達水平(圖4)。結果表明，CnHMGR基因在羅馬洋甘菊的根、莖、葉、花中均有表達，其中在花中的表達量最高，其次是根和葉，而在莖中表達量最低。

圖4 CnHMGR在羅馬洋甘菊不同組織的表達水平Fig.4 Expression pattern of CnHMGR among different tissues of Chamaemelum nobile

3 討論

倍半萜在植物體內多以醇、酮、苷或內酯的形式存在，羅馬洋甘菊中的倍半萜化合物主要有α-甜沒藥醇及其氧化物，以及母菊薁、金合歡烯等，藥理學研究表明倍半萜類物質具有抗菌、抗氧化、消炎、抗痙攣、抗癌、抗腫瘤、抗神經毒性、保肝等生物活性，是醫(yī)藥、食品、化妝品工業(yè)的重要原料[11，19]。研究表明倍半萜類化合物生物合成主要通過甲羥戊酸(MVA)途徑，HMGR是甲羥戊酸(MVA)合成途徑中的關鍵基因，對甲羥戊酸代謝“碳流”的調控起重要作用，改變HMGR活性可有效調控萜類化合物含量。利用轉基因技術將HMGR基因在植物中超表達可提高倍半萜類化合物含量[7，20-21]。例如馬鈴薯HMGR2和HMGR3的超表達可使與倍半萜植保素含量增加[22-23]，長春花HMGR基因在黃花蒿中過表達，可使倍半萜類物質青蒿素含量提高22.5%[24]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MVA途徑控制了黃花蒿萜類代謝途徑中80%的碳源，且HMGR作為該途徑的主要限速酶，其酶活性的調節(jié)直接影響了細胞中甲羥戊酸的儲蓄和青蒿素的積累[25]。鑒于此，本研究克隆了羅馬洋甘菊中倍半萜合成途徑中的關鍵基因HMGR基因，并分析了該基因的組織表達模式，可為利用基因工程技術提高羅馬洋甘菊倍半萜類化合物含量提供基因資源與理論基礎。

生物信息學表明CnHMGR蛋白與其他植物的HMGR蛋白具有高度的同源性，并包含4個保守基序，即NADPH結合基序：TVGGGT、DAMGMNM和HMG-CoA結合基序：TTEGCLVA、EMPVGYVQIP。CnHMGR蛋白的HMG-CoA結合基序中TTEGCLVA中的谷氨酸(Glu)可能在HMGR的催化功能發(fā)揮著重要作用。研究表明，HMG-CoA結合基序(EMPVGYVQIP)在各植物之間的多樣性對于HMGR催化底物的選擇可能發(fā)揮著重要作用[18，26]。CnHMGR包含該保守基序，推測也具有底物選擇的功能。通過進化樹分析結果可見，羅馬洋甘菊與萬壽菊親緣關系最近，推測CnHMGR與萬壽菊HMGR蛋白具有相似的催化活性，羅馬洋甘菊與其他雙子葉、及單子葉植物也具有親緣關系，反映了植物HMGR基因在進化上的多樣性，同時也表明HMGR是萜類生物合成途徑中1個十分保守的基因。利用鄰接法構建的HMGR系統(tǒng)進化樹雖然只能在一定程度上反映各物種之間的進化關系，但對物種間親緣關系的判定仍具有一定的參考價值。

研究表明，HMGR基因在不同植物組織表達模式呈現(xiàn)出較大的差異，例如，在南非醉茄(Withaniasomnifera)中表達量最高，花中表達量最少[27]；在人參花中表達量最高，莖中表達量最低[28]；在露水草中根和葉表達豐富[15]；在積雪草節(jié)點表達最高，在根部表達最低[16]。HMGR基因的特異性表達通常與類固醇或倍半萜積累相關，如在丹參[12]、銀杏[10]、黃花蒿[24]、白木香[29]中，HMGR的表達量分別與銀杏內酯和白果內酯、青蒿素、沉香倍半萜、丹參酮的含量呈正相關。本研究中實時定量PCR檢測結果顯示CnHMGR在花中的表達量最高。該結果表明CnHMGR在羅馬洋甘菊中的表達具有組織特異性，該表達模式可能和羅馬洋甘菊倍半萜的合成與積累部位有關。已有文獻報道羅馬洋甘菊的花器官中富含精油及倍半萜類化合物，其含量顯著高于其他組織[30]，CnHMGR在花中的表達水平最高，可能與倍半萜類化合物的合成呈正相關，暗示了HMGR可能具有調控倍半萜化合物的功能。

本課題組前期的轉錄組測序結果顯示羅馬洋甘菊HMGR基因家族中存在眾多成員，本研究克隆的CnHMGR基因僅為其家族中的一個成員。因此，在后續(xù)研究中，需進一步對羅馬洋甘菊HMGR基因家族的其余成員進行克隆及功能分析，并研究它們在催化功能上的異同點，為后期開展羅馬洋甘菊HMGR基因家族調控倍半萜類化合物生物合成的分子機制研究提供基礎理論。

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Cloning and Expression Analysis of HMGR Gene from Chamaemelum nobile

MENG Xiangxiang1，YAN Jiaping1，LIU Xiaomeng1，LIAO Yongling1，CHANG Jie2，3，XU Feng1

(1.College of Horticulture and Landscape Architecture，Yangtze University，Jingzhou 434025，China；2.Hubei Collaborative Innovation Center of Targeted Antitumor Drug，Jingmen 448000，China；3.College of Chemical Engineering and Pharmacy，Jingchu University of Technology，Jingmen 448000，China)

3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR) is one of the key rate-limiting enzymes in mevalonic (MVA) pathway of terpenoid biosynthesis.To analysis the function ofHMGRgene in terpenoid biosynthesis inChamaemelumnobile，aHMGRgene (designated asCnHMGR，GenBank accession number KU589282) was cloned fromC.nobileusing RT-PCR method.The full-length cDNA ofCnHMGRgene was 1 856 bp and contained an open reading frame (ORF) of 1 746 bp，which encodes a 582 amino-acid protein.The theoretical molecular weight and PI of theCnHMGRwere 62.5 kDa and 6.80，respectively.Multi-alignment comparison analysis showed the protein sequence of CnHMGR had high similarity with those of HMGR proteins from other plants.Furthermore，CnHMGR has two HMG-CoA-binding motifs：TTEGCLVA，EMPVGYVQIP，and two NADP(H)-binding motifs:TVGGGT,DAMGMMM,suggesting CnHMGR is one of HMGR family mumbers inC.nobile.The results of tissue expression analysis showed thatCnHMGRwas constituently expressed indifferent tissues ofC.nobile，with highest expression level in flowers and lowest expression level in stems.The present study cloned，characterized and analyzed the tissue expression pattern ofCnHMGRinC.nobile，providing basic data for further studying the function ofCnHMGRin sesquiterpene biosynthesis ofC.nobile.

Chamaemelumnobile；CnHMGR；Gene cloning；Tissue expression

2016-06-05

國家自然科學基金項目(31400603)；大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201207014)

孟想想(1991-)，女，安徽蚌埠人，在讀碩士，主要從事植物分子生物學研究。

許 鋒(1979-)，男，湖北武漢人，教授，博士，主要從事藥用植物次生代謝研究。

Q78；S682.03

A

1000-7091(2016)06-0068-08

10.7668/hbnxb.2016.06.011